响应面分析法优化超声波提取密蒙花黄色素工艺

罗堾子，孔永强，张 弘*，郑 华，张加研，李 凯

(1.中国林业科学研究院资源昆虫研究所，云南 昆明 650224；2.西南林业大学木质科学与装饰工程学院，云南 昆明 650224；3.景谷林化有限公司，云南 景谷 666400)

响应面分析法优化超声波提取密蒙花黄色素工艺

罗堾子1,2，孔永强3，张 弘1,*，郑 华1，张加研2，李 凯1

(1.中国林业科学研究院资源昆虫研究所，云南 昆明 650224；2.西南林业大学木质科学与装饰工程学院，云南 昆明 650224；3.景谷林化有限公司，云南 景谷 666400)

以水为介质、密蒙花黄色素水溶液的吸光度为考察指标，优化超声波强化提取密蒙花黄色素的工艺。选取超声波功率、提取时间和液料比为影响因素，在单因素试验基础上，进行三因素三水平的Box-Behnken中心组合试验设计，以密蒙花黄色素的吸光度为响应值进行响应面(RSM)分析，优化超声波强化提取密蒙花黄色素的提取条件。结果表明：超声波处理密蒙花有利于黄色素的浸出，超声波强化提取最佳条件为提取功率800W、提取时间24min、液料比27:1(mL/g)；在最佳提取条件下，密蒙花黄色素吸光度理论值可达0.257，验证值为0.259，验证值与理论值间的相对误差为0.78%。密蒙花黄色素得率达5.95%。

超声波提取；密蒙花黄色素；响应曲面

Abstract：Yellow pigment in flowers ofBuddleja officinalisMaxim was extracted by water with the assistance of ultrasound.The effects of ultrasound power, extraction time, water-to-solid ratio on the yield of yellow pigments (expressed as the absorbance of extract at 435 nm) were studied by conducting single factor tests. Then Box-Behnken experimental design involving the above 3 factors at 3 levels was employed, and coupled with response surface analysis to optimize the extraction conditions. Results showed that ultrasound treatment accelerated the extraction of yellow pigment. The optimum extraction conditions were as follows:ultrasound power 800 W, extraction time 24 min, the ratio of water to solid 27:1. Under such conditions, the theoretical absorbency ofBuddleja officinalisMaxim yellow pigment can reach 0.257, while the experimental value is 0.259, with a relative stand error 0.78% to the theoretical value. The yield of yellow pigment reached up to 5.95% .

Key words：ultrasound-assisted extraction；Buddleja officinalisMaxim yellow pigment；response surface

密蒙花(Buddleia officinalisMaxim)为马钱科醉鱼草属植物，中国南方和西部均有分布，在我国西南壮族、布依族、傣族及汉族地区，仍保持有用密蒙花新鲜或干燥花蕾与米饭共蒸煮食用的习俗，做出的米饭色泽鲜亮、自然，具有密蒙花花朵的清香[1]且有抑菌作用[2-3]，因此又名染饭花[4-5]。中医则将其干燥花蕾用作药材，有祛风清热、润肝明目等功效[6-7]，故为药食同源植物。密蒙花主要着色成分为藏红花苷(crocin)与密蒙花苷(linarin)，溶于水、稀醇和稀碱溶液，几乎不溶于乙醚或苯等有机溶剂，其色泽随pH值变化而变化，具有着色力强，染色效果好[8]，在食品饮料中色泽稳定的优点[9-11]，研究未发现诱变活性，其毒性也很小[12]，是一种较理想的天然食用色素[7]。密蒙花传统提取方法常用水浸泡法或醇提法[13]，时间长，费时费力。本研究拟利用超声波物理场强化提取密蒙花黄色素，通过对超声波功率、超声时间以及液料比单因素的试验，应用响应曲面法(response surface method，RSM)对密蒙花黄色素的超声波提取条件进行优化，以期达到高效地提取密蒙花黄色素的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

密蒙花，采自云南省景谷县，阴干后用粉碎机将密蒙花粉碎成段，混合均匀备用。以实验室自制去离子水作为提取试剂。

1.2 仪器与设备

BILON99-ⅡDL超声波细胞粉碎机(φ=25mm号超声变幅杆) 上海比朗仪器有限公司；DU800紫外-可见光分光光度计 美国贝克曼库尔特有限公司；721型可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；Prep/scale 超滤系统、超滤膜(螺旋卷式再生纤维素膜，截留分子质量为5kD，膜分离有效面积为0.54m2) 美国Millipore 公司；N1000·Rotavapor RII旋转蒸发仪 日本东京理化仪器公司；AB204-S精密型电子天平 Mettler Toledo中国有限公司；HR83-P型快速卤素水分测定仪 梅特勒-托利多(中国)有限公司；TY742X2A纯水机 美国Barnstead公司。

1.3 方法

1.3.1 密蒙花黄色素提取工艺

工艺流程：密蒙花干品→水浸泡→超声波强化提取→初滤→微滤→超滤[14]→真空浓缩→真空干燥→黄色素。

操作要点：以实验室自制去离子水作为提取剂；超声波固定频率为20kHz。

1.3.2 最大吸收波长的确定

密蒙花干品10g，用300mL去离子水浸泡10min，在超声波功率600W条件下超声20min，脉冲时间2s，间隙时间8s过滤后取其中滤液5mL，用50mL容量瓶定容，用DU800紫外-可见光分光光度计进行全波段扫描，以可见光区最高吸收峰为特征波长。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 超声波功率对密蒙花黄色素提取的影响

密蒙花粉碎干品10g，用300mL蒸馏水浸泡10min，分别在超声波功率为200、400、600、800、1000、1200W条件下超声20min(脉冲时间2s，间隙时间8s)，同时控制超声温度在40℃以下，超声处理后，过滤，取滤液5mL，用50mL容量瓶加去离子水定容，在最大吸收波长处测吸光度。

1.3.3.2 超声波时间对密蒙花黄色素提取的影响

其他条件同1.3.3.1节，并在1.3.3.1节确定的最优超声波功率下分别超声5、10、15、20、25、30min，在最大吸收波长处测吸光度。

1.3.3.3 液料比对密蒙花黄色素提取的影响

其他条件同1.3.3.1节，分别按液料比25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1(mL/g)取对应体积蒸馏水浸泡，在

1.3.3.1 和1.3.3.2节所确定的最超声波功率和时间条件下进行超声处理，在最大吸收波长处测吸光度。

1.3.4 响应曲面试验设计

根据单因素试验结果，选择超声波功率、超声波时间和液料比3个因素作为响应变量，利用Minitab软件按照Box-Behnken中心组合试验设计原理，以密蒙花黄色素水溶液的吸光度为响应值，通过响应曲面分析进行制备条件的优化，从而得到最优制备条件。各试验组的编码与取值见表1，共15个试验点，其中12个为析因点，3个为零点，零点试验进行3次，作误差估计。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Variables and levels of the three-variable, three-level central composite rotatable design

1.3.5 密蒙花黄色素的提取

根据响应曲面法所得结果，按最佳工艺条件提取密蒙花黄色素水提液，并采用超滤膜精制，得到较纯密蒙花黄色素。

1.3.6 提取级数的确定

称取10g密蒙花粉碎干品，以超声波强化法的最佳提取条件进行提取，总共提取n次，将每次的提取液抽滤，分别测定其在最大吸收波长的吸光度，计算浸提率[15]，从而确定合理的提取级数。

式中：A为每次测得的吸光度；A总为提取n次后所有吸光度之和。

1.3.7 提取得率的计算

称取一定质量(m1)的密蒙花粉碎干品(含水率x1)，分别采用水浸提法在其最佳条件下对其中的色素进行提取，然后对色素溶液进行浓缩、干燥等处理，得到质量为m2的色素样品(含水率x2)，计算密蒙花黄色素的提取得率[15]。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

由图1可知，密蒙花黄色素在紫外光区和可见光区分别有一个吸收峰。但可见光区的吸收峰较平缓，不太明显。由图2可知，密蒙花黄色素水溶液在可见光区的最佳吸收波长为435nm。本实验密蒙花黄色素水溶液吸光度均设在波长435nm处测得。

图1 全波长扫描Fig.1 UV-Vis absorbency spectrum of the yellow pigment solution

图2 可见光区波长扫描Fig.2 Visible wavelength absorbency spectrum of the yellow pigment solution

2.2 单因素试验结果

2.2.1 超声波功率

图3 超声波功率对吸光度的影响Fig. 3 Effect of ultrasound power on absorbency of the yellow pigment solution at 435 nm

从图3可知，吸光度整体呈上升趋势，即随着功率增大，吸光度增大，这是因为随功率增大，超声波强度达到或超过了空化阀声压，空化作用明显，因而吸光度增大。但超声波功率大于800W后增加缓慢，这可能是因为功率到达800W后，空化作用已经达到最大，后面再增大功率，作用也不明显。因此，超声波最佳功率选择为800W。

2.2.2 超声波时间

图4 超声时间对吸光度的影响Fig.4 Effect of ultrasound treatment time on absorbency of the yellow pigment solution at 435 nm

从图4可知，随超声时间的延长，吸光度增加，原因是当细胞受超声波作用时，细胞内产生剧烈涡流扩散，增大细胞内外有效成分的浓度差，从而加快溶质的传质速率，渗透性增加，因此随超声波时间的延长，将会有更多的溶剂渗透进入细胞的内部，从而使更多的有效成分透过细胞壁进入到周围的溶剂中。但当超声时间到达20min后，吸光度增加开始不明显，这可能是因为，细胞内有效物质渗透已达最大，溶剂达到饱和。因此，最佳的超声时间选择为20min合适。

2.2.3 液料比

图5 液料比对吸光度的影响Fig.5 Effect of ratio of water to solid on absorbency of the yellow pigment solution at 435 nm

由图5可知，当液料比从15:1增加到30:1时，密蒙花黄色素溶出随之增多，此后继续增大液料比，密蒙花黄色素吸光度不再增加，反而减少，这是由于对于一定质量的密蒙花来说，增加溶剂用量，参透压增大，黄色素越容易渗透出来，提取速率加快，一定时间内的黄色素溶液吸光度就会增加，黄色素得率增加，当溶剂用量达到一定程度后，因为黄色素基本全部溶出，所以继续增加溶剂用量，黄色素溶液吸光度不再增加。因此，最佳液料比选择为30:1。

2.3 响应曲面分析

2.3.1 响应面设计试验结果分析

运用Minitab数据统计分析软件，得到试验方案与结果，如表2所示。

表2 Box-beknhen试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of the three-level, threevariable Box-Behnken experimental design

利用Design-Expert软件对表2数据进行二次多元回归拟合，得到密蒙花黄色素水溶液吸光度的二次多项回归方程：Y=0.25＋0.009A＋0.018B－0.018C－0.015A2－0.009B2－0.018C2－0.003AB＋0.011AC＋0.005BC。

表3 回归方程偏回归系数的估计值Table 3 Estimated values of the partial regression coefficients of the regression model

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis for the regression model

回归模型系数的显著性检验结果残差的平方和为90.36% ，说明此模型与数据拟合度较高，从表3回归模型系数显著性检验结果可以看出，模型的一次项中B、C均显著，其中B影响程度最为显著，C其次。二次项A2、C2显著，交互影响均不显著。由此可知，各影响因素对吸光度的影响不是简单的线性关系。

进一步对该回归模型进行显著性检验，相应数据的方差分析结果见表4，回归项P＝0.042＜0.05，回归模型显著，失拟项P＝0.051＞0.05，不显著，说明模型拟合度良好，可用此模型来分析和预测超声波提取密蒙花黄色素的吸光度。

2.3.2 响应曲面分析与优化

图6 超声波功率和时间对吸光度影响的响应面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plot showing the effects of ultrasound treatment time and power on absorbency of the yellow pigment at 435 nm

图7 超声波功率和液料比对吸光度影响的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour plot showing the effects of ultrasonic power and ratio of water to solid on absorbency of the yellow pigment at 435 nm

图8 超声波时间和液料比对吸光度影响的响应面和等高线图Fig.8 Response surface and contour plot showing the effects of ultrasonic treatment time and ratio of water to solid on absorbency of the yellow pigment at 435 nm

根据回归方程作出模型的响应曲面及其等高线见图6～8，三组图直观反映了各个因素对响应值的影响。利用Minitab软件进行试验结果优化，由于本试验主要目的在于优化超声波处理条件，在短时间内最大程度的提高吸光度，通过分析得到的最佳工艺条件：功率=0.07，时间=0.88，液料比=－0.35。换算得到的实际值分别为超声波功率800W、超声时间24min、液料比27:1，在此条件下提取，密蒙花黄色素吸光度的理论值为0.257。

2.3.3 验证实验结果

为检测响应曲法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行3次平行实验，实际测得的平均吸光度为0.259，试验值与理论值相对误差为0.78%，证明应用响应曲面优化密蒙花黄色素提取工艺可行。

2.4 密蒙花黄色素的制备

根据响应曲面法所得最佳工艺条件及提取工艺流程提取密蒙花黄色素，采用超滤膜精制后，得到较纯密蒙花黄色素0.614g，含水率12.48%，密蒙花黄色素的提取得率为5.95%。

2.5 密蒙花黄色素提取级数

图9 密蒙花黄色素提取级数Fig.9 Yield of yellow pigment versus extraction times

由图9可知，前6级的浸提率占全部提取量的90.94%，后面的浸提率都不高，因而提取密蒙花黄色素提取6级即可。

3 结 论

经过优化后最佳提取密蒙花黄色素工艺条件为超声波提取功率800W，超声时间24min，液料比27:1(mL/g)，此条件下密蒙花黄色素水溶液吸光度为0.259。根据提取工艺流程，得到较纯密蒙花黄色素0.614g，其提取得率为5.95%，提取级数为6级。

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Ultrasound-assisted Extraction of Yellow Pigment fromBuddleja officinalisMaxim Flowers

LUO Chun-zi1,2，KONG Yong-qiang3，ZHANG Hong1,*，ZHENG Hua1，ZHANG Jia-yan2，LI Kai1
(1. Research Institute of Resources Insects, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China；2. College of Woody Science and Decorative Engineering, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China；3. Jinggu Chemical Engineering of Forest Products Co. Ltd., Jinggu 666400, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)22-0352-05

2010-07-23

科技部农业科技成果转化资金项目(2010GB24320619)；国家林业科技成果推广项目([2010]11)

罗堾子(1987—)，女，硕士研究生，主要从事林产化学与加工研究。E-mail：chunzi441571066@sina.com

*通信作者：张弘(1963—)，男，研究员，学士，主要从事林业生物资源化学与利用研究。E-mail：kmzhhong@163.com