油菜籽多酚的分布及加工过程对菜籽多酚含量的影响

刘 琴，吴 梨，石嘉怿，鞠兴荣*

(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，江苏 南京 210003)

油菜籽多酚的分布及加工过程对菜籽多酚含量的影响

刘 琴，吴 梨，石嘉怿，鞠兴荣*

(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，江苏 南京 210003)

对油菜籽壳粕和脱壳后的菜籽肉粕中提取液的总酚含量、对DPPH自由基清除能力以及FRAP抗氧化能力进行比较，并采用液质联用法对提取液中的主要成分进行鉴定，对其中的芥子酸和芥子碱进行定量分析。结果表明：菜籽肉粕提取液中的总酚含量、对DPPH自由基清除能力以及FRAP抗氧化能力约为菜籽壳粕中的两倍，芥子酸和芥子碱的含量分别为菜籽壳粕中的约2.5倍和1.5倍。通过对实验室溶剂除油的菜籽粕与工业高温粕比较发现，高温榨油过程会使菜籽的总酚含量、抗氧化性、芥子酸和芥子碱含量有所下降，其中总酚含量下降了12.06%，DPPH自由基和FRAP抗氧化值分别降低10.0%和5.6%，芥子酸和芥子碱含量分别下降了5.6%和21.12%。

油菜籽；多酚；抗氧化性；液质联用；芥子碱；芥子酸

Abstract：Six binary solvent systems were used to extract industrial high-temperature rapeseed meal (a byproduct of rapeseed oil extraction at a temperature ranging from 110 to 115 ℃ after steaming at 115 ℃), and a mixture of ethanol and 1 mol/L HCl(7:3,V/V) was the selected solvent system for further studies in view of higher extraction efficiency, DPPH radical scavenging activity and ferric reducing antioxidant power (FRAP) as well as environmental friendship. The following studies included comparisons on total polyphenol content, DPPH radical scavenging activity and FRAP value among the extracts from the residues left after oil extraction from rapeseed shell and kernel, solvent extraction-derived rapeseed meal and industrial hightemperature rapeseed meal, HPLC-MS/MS identification of major components of the extract from solvent extraction-derived rapeseed meal and quantification of sinapine and sinapic acid in it. The total polyphenol content, DPPH radical scavenging activity and FRAP value of the extract from the residue left after oil extraction from rapeseed kernel were all approximately 2-fold higher than those of the extract from rapeseed shell with oil extraction and the contents of sinapic acid and sinapine exhibited approximately 2.5- and 1.5-fold increases, respectively. The comparison between solvent extraction-derived rapeseed meal and industrial high-temperature rapeseed meal indicated that during high-temperature oil extraction, total polyphenol content,DPPH radical scavenging activity, FRAP value and the contents of sinapic acid and sinapine decreased by 12.06%, 10.0%, 5.6%,5.6% and 21.12%, respectively.

Key words：rapeseed；polyphenol；antioxidant activity；HPLC-MS/MS；sinapine；sinapic acid

油菜是世界上仅次于大豆的第二大油料作物，也是我国产量最大的油料作物，年产量超过1000万t，近两年出现了产量持续增长的趋势。菜籽粕是菜籽油加工的主要副产品，但由于其中含有硫代葡萄糖苷、植酸、单宁等多酚类物质，使其开发利用受到一定限制，长期以来只能作为低价的饲料或者肥料使用。经过三系杂交及基因工程育种培育出来的新菜籽品种“双低”菜籽品种使得菜籽中的有毒成分硫代葡萄糖苷和芥酸的含量显著降低，而得以广泛种植[1]。但B.napus系中控制芥子碱含量的基因稳定，所以菜籽粕中仍有较高含量的多酚存在[2]。多酚的存在使得由菜籽粕加工的产品如菜籽蛋白、菜籽肽等具有苦涩味并影响蛋白质的吸收，因此菜籽粕副产品加工过程中菜籽多酚的去除是其中的步骤之一。然而，多酚类化合物普遍具有的抗氧化作用、抑菌作用又使得菜籽多酚具有作为天然抗氧化剂或抑菌剂的潜在应用价值。

严奉伟等[3-4]围绕菜籽多酚的提取、分离、纯化和活性评价进行了一系列的研究，但未见对提取出来的多酚化合物进行进一步的鉴定和分析的报道。国外已有大量的数据表明菜籽中的主要多酚物质是芥子碱、芥子酸及其衍生物[5-6]，并对不同基因品种中的菜籽多酚的含量进行了研究[7-8]，但是目前我国还没有这些数据的报道。多酚类化合物在植物中的含量与基因品种、环境和气候条件都有关系[5]。为了研究菜籽多酚在菜籽粕副产品加工过程中潜在的利用价值，对我国产的油菜籽中多酚的分析也是必不可少的。

本研究通过用不同的溶剂对菜籽壳粕、除壳后的菜籽肉粕、溶剂除油后的菜籽粕以及工业高温粕提取液中总酚、清除DPPH自由基能力和FRAP值进行比较分析，并用HPLC-MS结合MS-MS的方法，对菜籽多酚的组分进行鉴定，对其中的主要组分芥子碱和芥子酸进行定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普通市购菜籽(外观黑色，产地江苏)、高温粕(菜籽经115℃蒸炒，再经110～115℃热榨后，用6号溶剂浸提后的粕) 南京隆盛植物油脂有限公司。

芥子酸、Trolox(水溶性VE)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH自由基)、2,4,6-三(2＇-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)Sigma-Aldrich公司；芥子碱硫氰酸盐 北京锐鑫农科贸易有限公司；Folin-酚试剂(使用前稀释10倍) 上海世泽生物科技；甲醇(色谱纯) Fisher公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100HPLC-MSD(SL)高效液相色谱与质谱联用仪(带自动进样器)、Zorbax S B2 C18反相色谱柱(4.6mm×150mm，5μm) 美国Agilent公司；Milli-Q Academic超纯水系统 美国 Millipore公司；725型分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；低温高速冷冻离心机 上海飞鸽离心机厂；高速万能磨碎机 天津泰斯特仪器有限公司；JLG45砻谷机 浙江黄岩粮仪厂。

1.3 方法

1.3.1 样品的预处理

菜籽在砻谷机中碾压去壳，得到分离的菜籽壳和菜籽肉，用高速粉碎机粉碎后，使用石油醚(40～60℃)用索氏提油装置经12h抽提脱油，室温下晾干除去溶剂后再次粉碎，分别过40目筛。高温粕和带壳菜籽粕在使用前按上述步骤同样进行样品处理。所有得到的原料均采用105℃恒质量法测定水分含量。

1.3.2 多酚的提取

取不同的菜籽粕样品0.5g实验，用10mL溶剂在25℃下振荡萃取2h，离心后取上层清液用Folin-酚法测定总酚含量，DPPH法和FRAP法测定抗氧化性。剩余清液用旋转蒸发仪蒸干后加5mL 50%的甲醇重新溶解后用HPLC-MS进行分析。实验中所用到的相关溶剂及组成为：甲醇酸、乙醇酸、丙酮酸 (醇-酮与1mol/L HCl 体积比为7:3)；甲醇水、乙醇水、丙酮水 (醇-酮与水的体积比为7:3)。

1.3.3 总酚含量的测定

本实验总酚的测定采用Folin-Ciocalteu法[9]。具体操作为：取0.4mL菜籽多酚提取液，加入3.9mL Folin-酚工作液，混合均匀5min后加入3mL 60g/L饱和碳酸钠溶液，25℃条件下反应90min后于725nm 波长处测吸光度。用芥子酸做标准品，结果用芥子酸当量表示，即每克菜籽粕干质量相当于芥子酸的毫克数[9]。

1.3.4 抗氧化性测定方法

本实验抗氧化性的测定方法参照Thaiponga 等[10]所用DPPH法和FRAP法。

1.3.4.1 FRAP法

TPTZ工作液的配制：取10mmol/L TPTZ溶液2.5mL，0.3mol/L醋酸钠缓冲液(pH3.6)25mL，20mmol/L的FeCl3溶液2.5mL混合均匀后置于35℃水浴中孵化30min后使用，即用即配。测定时取菜籽多酚提取液0.1mL，加入TPTZ工作液0.9mL，于35℃水浴中反应30min，593nm波长处测吸光度。以硫酸亚铁溶液作标准曲线，抗氧化能力表示为硫酸亚铁当量(mmol/g)，即每克菜籽粕FRAP抗氧化能力相当于FeSO4毫摩尔数。

1.3.4.2 DPPH法

具体操作为，取稀释一定倍数的提取液0.1mL，加入3.9mL 0.1mmol/L的DPPH溶液，于25℃水浴反应60min，于515nm波长处测其吸光度，用水溶性VE做标准品， 结果用Trolox当量表示(mmol/g)，即每克菜籽粕干质量对DPPH自由基清除能力相当于Trolox的毫摩尔数。

1.3.5 用HPLC-MS结合MS-MS对菜籽多酚提取液的分析

将 10μL的提取液由自动进样器进样，经HPLC分离后导入质谱分析仪进行分析，在分析中采用的液相色谱条件为：以含0.1% HAc 的水为流动相A，含0.1%HAc的甲醇为流动相 B，控制流速为 0.5mL/min，柱温为 25℃，按照如下梯度洗脱：0～10min，10%～30%B；10～30min，30%～40% B；40～50min，40%～60%B；50～55min，100% B；55～65min，100%～10% B；65～70min，10% B。采用DAD检测器，检测波长为190～400nm。

质谱条件：雾化气(N2)30Psi ；干燥气(N2)10mL/min；毛细管温度为350℃，毛细管电压为在正离子模式下采用3.5kV，负离子模式下为3.0kV。在芥子碱分析时采用正离子模式，其他组分的分析为负离子模式。

对菜籽多酚提取液中的芥子酸与芥子碱定量分析分别以芥子酸和芥子碱硫氰酸盐为标准物质。在波长320nm波长处按峰面积进行分析。在上述液相条件下，芥子酸在含量5～25μg/mL范围内得到的标准曲线为：A=31.232B－8.8008(R2=0.9985)，芥子碱在50～200 μ g/mL范围的标准曲线为：A=18.467B－28.34(R2=0.9994)，式中A为吸光度，B为质量浓度(μg/mL)。

1.4 统计分析

所得数据均为3次平行测定的平均值，并用SPSS16.0对测定数据进行ANOVA 及多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 高温菜籽粕不同溶剂提取液的总酚含量及抗氧化性比较

表1 不同溶剂提取液中总酚含量和对DPPH自由基的清除能力及FRAP值Table 1 Total polyphenol contents (TPCs), DPPH radical scavenge capacities and FRAP values of different solvent extracts from industrial high-temperature rapeseed meal

由表1可知，在实验所采用的6种提取溶剂中，酸化后的溶剂所得到提取液中总酚含量，对DPPH自由基清除能力和FRAP值均明显高于不含酸的提取剂(P＜0.05)，其中丙酮酸提取液中总酚和抗氧化能力最高，乙醇酸其次，甲醇酸略低于乙醇酸。总酚含量与DPPH自由基清除能力和FRAP值均显著相关(P＜0.05，r分别为0.944和0.939)。从提取效率和环境友好性考虑，在后续实验中，均采用乙醇酸作为提取剂。

2.2 菜籽不同组成部分的乙醇酸提取液中总酚含量及抗氧化能力的比较

通过上述提取剂优化实验，选择乙醇酸对除油后的菜籽壳、脱壳菜籽肉和菜籽粕(不经过脱壳处理)以及工业高温粕样品用上述方法进行提取，并对提取液中总酚含量和抗氧化能力进行比较，结果见表2。

表2 菜籽壳粕、脱壳菜籽肉粕、高温粕、菜籽粕提取液中总酚含量和DPPH自由基清除能力及FRAP值Table 2 TPCs, DPPH radical scavenge capacities and FRAP values of the extracts from different residues after rapeseed oil extraction

由表2可知，脱壳菜籽肉粕中的总酚以及抗氧化性显著高于菜籽壳粕(P＜0.05)，脱壳菜籽肉粕多酚的含量约为菜籽壳粕中的两倍，而提取液清除DPPH自由基的能力和FRAP抗氧化性也为菜籽壳粕提取液的近两倍。实验室除油后的菜籽粕的总酚含量和抗氧化性明显高于高温粕(P＜0.05)。总酚含量与DPPH自由基清除能力和FRAP值显著相关(P＜0.05)，r分别为0.997和0.965。

2.3 菜籽中多酚结构的鉴定

为了全面的分析菜籽中的多酚种类，本实验对实验室溶剂除油后的菜籽粕的乙醇酸提取液用HPLC-MS结合MS-MS进行了分析。图1是该提取液在320nm波长处的液相色谱图，在菜籽多酚直接提取液中，有8个比较明显的峰，它们的保留时间、对应的质谱峰以及二级质谱产生的碎片峰见表3。

图1 菜籽粕乙醇酸提取液的HPLC液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram recorded at 320 nm of the extract from solvent extraction-derived rapeseed meal

表3 菜籽粕乙醇酸提取液中主要组分的保留时间、对应的质谱峰、二级质谱碎片峰及对应的化合物Table 3 Mass spectral data of the major components in the extract from solvent extraction-derived rapeseed meal

从图1可以看出，峰1是菜籽提取液中的主要组分，在负离子模式下未能检测到该组分的质谱峰，在正离子模式下该峰的m/z值为310.2，即相对分子质量为309.2，与芥子碱一致，该组分的保留时间和紫外吸收光谱也与芥子碱(图2)一致。而二级质谱显示的碎片峰m/z为251.2，即为芥子碱失去一个季胺基碎片(－59)所得，由此确定峰1为芥子碱[11]。

图2 芥子酸与芥子碱紫外吸收光谱Fig.2 UV absorption spectra of sinapic acid and sinapine

峰2和3的m/z均为385.2，它们的MS-MS其中一个碎片峰为223.1，与芥子酸的m/z一致，该值与母离子385.2相差162，为典型的葡萄糖苷键断裂(图3结构式)，故该两个组分均为芥子酸糖苷，另一个碎片峰205.1为芥子酸失去一个水而产生的。出现两个峰保留时间不一样说明与芥子酸相连的葡萄糖具有不同结构，互为异构体。峰4的m/z为561.2，对应的二级质谱碎片峰有432.2和208.2，目前还无法由质谱确定该组分的组成。峰5和峰6所对应的m/z均为223.1， 所对应化合物的相对分子质量为224.1，与芥子酸一致。它们的二级质谱对应的碎片峰m/z均为208.0、179.0和164.0。根据碎片判断，碎片208为从母离子223.1中失去了一个甲基而产生，碎片179.0为母离子失去了一个羧酸根而产生；而164为从母分子中失去一个甲基和一个羧酸根而产生，与芥子酸的结构相吻合。不同点为：在相同的撞击能量下，峰5所对应碎片峰中强度最大的为164.0，而峰6为208.0，标准品顺式芥子酸的保留时间与和碎片与峰6相同，所以峰5对应的可能是反式芥子酸。峰7的m/z为751.1，所得二级质谱碎片峰主要为529.1和223.1，该组分的分子质量和碎片均与文献[12]报道的二芥子酸龙胆二糖苷一致，根据化合物的结构，碎片m/z为529的产生为母离子失去一个中性的芥子酸，而223的产生为母离子失去一个芥子碱龙胆二糖苷(sinapoylglucose)产生的。峰8(m/z591.1)的二级碎片峰367.1和223.1，该峰与文献[12]所报道的二芥子酸葡萄糖苷一致，其碎片也与该结构吻合：碎片m/z367.1为母离子591.1失去一个中性芥子酸(224)而得到，而碎片m/z为223.1为母离子失去芥子酸葡萄糖苷而得到。

图3 芥子碱(a)、芥子酸(b)和芥子酸葡萄糖苷(c)的结构式Fig.3 Structures:(a) sinapine; (b) sinapic acid; and (c)sinapoylglucoside

2.4 菜籽不同组成部分的的芥子酸和芥子碱的定量分析以及加工对其含量的影响

由HPLC-MS和MS-MS的结果分析可以得出，菜籽中可溶性多酚提取液主要的成分为芥子碱和芥子酸的衍生物，于是对菜籽不同部位壳和肉中的芥子酸和芥子碱的含量进行比较，同时将高温粕和实验室除油处理的菜籽粕进行比较，结果如表4所示。

表4 菜籽壳粕、脱壳菜籽肉粕、高温粕和菜籽粕中芥子碱和芥子酸的含量Table 4 Contents of sinapine and sinapic acid in different residues after rapeseed oil extraction

由表4可知，菜籽粕中芥子碱的含量远远大于芥子酸的含量(P＜0.05)，实验室除油后的菜籽粕和脱壳菜籽肉粕中的芥子碱的含量达到了芥子酸含量的10～20倍以上。另外从菜籽壳粕和脱壳菜籽肉粕中的含量的对比可以看出，芥子碱在壳粕和肉粕中的含量显著不同(P＜0.05)，在肉粕中芥子碱的含量是壳粕的约2.5倍，而高温粕中的芥子碱含量比实验室溶剂除油的菜籽粕中大约下降了22%，这说明高温加工过程会对芥子碱产生影响。芥子酸同样是在肉粕里的含量大于壳里的含量，但不像芥子碱差别那么大，另外，尽管在高温下会被氧化，但是高温粕中的芥子酸的含量与实验室的除油后的粕中的含量并无明显不同，这可能是由于芥子碱在高温氧化下分解而产生一部分芥子酸，使得最后芥子酸的总含量并无明显变化所致。

3 结 论

本实验对菜籽多酚的不同提取剂的提取液中总酚和抗氧化性进行比较研究，结果表明：乙醇酸和丙酮酸对菜籽多酚的提取率最高，通过总酚和抗氧化性测定表明，脱壳菜籽肉粕中多酚乙醇酸提取液中的总酚含量和抗氧化性都明显高于菜籽壳粕的多酚提取液，大约为壳粕中的两倍。高温压榨过程会使菜籽总酚含量和抗氧化性都有所下降。通过对多酚提取液的HPLC-MS结合MSMS分析，发现菜籽多酚提取液主要是芥子碱、芥子酸以其衍生物，其中芥子碱为最主要成分，在菜籽粕中含量11.45mg/g，占质量百分比的1.108%，在高温粕中的含量为8.63mg/g，占质量百分比的0.863%；同时在脱壳菜籽肉粕中含量为14.043mg/g，占质量百分比1.4%，是壳中含量的2.5倍以上。芥子碱广泛分布与十字华科植物如莱菔子、白芥子等十字花科植物中，也是一些中药活性成分[13]。近代医学表明芥子碱具有抗菌、降压、抗衰老作用以及具有明显的抗辐射作用[14-15]，因此在菜籽粕中的高含量的芥子碱意味着菜籽多酚提取液作为一种加工副产品也具有一定的应用潜力。

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Distribution of Polyphenols in Rapeseed Shell and Kernel and Effect of Oil Extraction Methods on Their Content in Rapeseed Meal

LIU Qin，WU Li，SHI Jia-yi，JU Xing-rong*
(Key Laboratory of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China)

O625.31

A

1002-6630(2010)19-0033-05

2010-05-10

国家“863”计划项目(2007AA10Z331)

刘琴(1968—)，女，副教授，博士，研究方向为功能食品化学。E-mail：liuq_s@yahoo.com

*通信作者：鞠兴荣(1957—)，男，教授，博士，研究方向为粮油深加工技术。E-mail：xingrongju@163.com