聚环糊精-碳纳米管有机磷农药生物传感器

杨海朋，陈东成，李春辉，陈仕国，戈早川

（深圳大学材料学院，深圳市特种功能材料重点实验室，广东深圳518060）

0 引言

有机磷农药作为最常用的一类农药，在各种农作物尤其是瓜果蔬菜中被广泛应用，农药残留通过食物链传导到人体后成为致畸、致癌、致突变等恶性疾病的诱因，危害很大,因此对有机磷农药等的检测需求越来越多。测试的方法主要有仪器分析法、免疫分析法和生物传感器法[1～2]。目前广泛使用的气相色谱/质谱联用技术(GC/MS)和高效液相色谱(HPLC)等仪器分析方法,尽管能比较准确地检测农药的残留量,但存在设备大、移动性差、分析费用高以及分析周期较长等不足。免疫分析法特异性强,但操作复杂费时。电化学生物传感器的应用为实现农药快速、灵敏和简便的检测提供了可能，已经广泛用于有机磷农药的测定[1,3～5]。但是电化学生物传感器通常仅在一定的实验条件下使用状态良好,其实际应用的最大问题是稳定性不够好。对于生物传感器而言，制备新型固定化材料和固定化方法，改善传感器的生物敏感膜的性能，增加其稳定性和生物活性，是研制性能优良的生物传感器的关键[6]。

碳纳米管(CNT)所表现出的许多优良的性能使得对CNT的研究成为目前倍受关注的热点课题之一，其在生物传感器领域的应用也不断被拓展[3,7～8]。例如研究人员把碳纳米管分散于Nafion[9～10]、壳聚糖[11～12]等高聚物的溶液中制备的生物传感器，具有很好的检测灵敏度。然而，能够用于分散碳纳米管的此类高聚物非常有限。该课题利用环糊精作为分散剂来分散CNT，得到不溶于水的聚环糊精-碳纳米管复合导电膜，并在该膜上固定乙酰胆碱酯酶，制备了既能保持CNT优良的导电性能和电催化活性，又能维持很好的稳定性的有机磷农药生物传感器，为其实际应用奠定基础。

1 实验部分

1.1 主要试剂和仪器

试剂：多壁碳纳米管(MWNT)，外径10 nm，纯度95%（清华大学化工系生产）。乙酰胆碱酯酶 （AChE）， 酶活力为424单位/毫克 （sigma公司）；氯化硫代乙酰胆碱（sigma公司）。其它试剂，如 β-环糊精（β-CD）、甲胺磷、浓硝酸、25%戊二醛（GD）、盐酸、铁氰化钾、无水乙醇等均为分析纯试剂。含四个环糊精分子的预聚环糊精由实验室自制（β-CDP）。

主要仪器：电化学工作站(CHI660C)，上海辰华仪器有限公司。

1.2 传感器制备

把碳纳米管放入混酸（浓硫酸和浓硝酸按体积比3∶1）中于60°C回流4 h除杂。把CNT放入β-CD和β-CDP的混合溶液超声10 min。混合液中CNT的浓度为1 mg/mL。

用微量进样器吸取混合液20 μL置于干净的玻璃片上，加入 40 μL 2.5%戊二醛和 0.2 mol/L盐酸的等比例混合液。搅拌均匀后，用微量进量器吸取20 μL上述溶液滴到Pt电极上，室温下自然晾干后得到聚环糊精-碳纳米管（CDP-CNT）复合膜修饰电极。然后取5 μL乙酰胆碱酯酶溶液（0.1 U/μL）和 5 μL 2.5% 的戊二醛溶液滴到已干燥的复合膜修饰电极上，室温下自然晾干，即得到聚环糊精-碳纳米管复合膜有机磷农药生物传感器。

1.3 有机磷农药传感器的性能测试

利用CHI660C电化学工作站对制备的传感器进行循环伏安检测。采用三电极系统（参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极，工作电极为有机磷农药传感器）测量传感器在不同浓度甲胺磷抑制条件下对硫代乙酰胆碱溶液的电流响应曲线。

2 结果讨论

2.1 β-CD及β-CDP配比对修饰电极电化学性能的影响

把不同配比的β-CD和β-CDP修饰电极置于50 mmol/L的铁氰化钾（K3Fe(CN)6）溶液中进行循环伏安测试，所得曲线如图1所示。由图可知，2%β-CD和5%β-CDP混合溶液分散CNT制备的复合膜修饰电极的氧化-还原峰峰形对称性最好，峰值最大，说明CNT在以2%β-CD+5%β-CDP为基底组成的复合膜中分散效果最好，其修饰电极电化学性能优异。

2.2 有机磷农药生物传感器的性能检测

2.2.1 循环伏安曲线

图1 四种不同配比的β-CD和β-CDP制成的CDP-CNT复合膜修饰电极在50 mmol/L的铁氰化钾溶液中的循环伏安曲线图（扫描速度50 mV/s）Fig.1 The cyclic voltammetry curves of four different types of modified electrodes:the modified materials on the electrodes are the films prepared via 2%β-CD+5%β-CDP,2%β-CD+8% β-CDP,2%β-CD+2%β-CDP,and 5%β-CDP,respectively(50 mmol/L K3Fe(CN)6at 50 mV/s)

把制备好的有机磷农药生物传感器分别放入磷酸缓冲溶液和0.5 mmol/L氯化硫代乙酰胆碱溶液中进行循环伏安测试，电压扫描范围为-0.4 至 0.8 V，扫描速度 0.1 V/s，扫描结果见图 2。由图可见，传感器在不含底物的缓冲溶液中没有明显的氧化还原峰；在含有0.5 mmol/L底物的溶液中，则在0.4 V和0.1 V附近出现明显的氧化还原峰。胆碱在普通电极上的氧化电位为0.8 V左右[13]，而在目前的传感器电极上氧化电位降低为约0.4 V，说明碳纳米管对底物具有良好的电催化活性。

图2 有机磷农药生物传感器在磷酸缓冲溶液和0.5 mmol/L乙酰胆碱溶液中的循环伏安曲线（电压扫描范围为-0.4 至 0.8 V，扫描速度 0.1 V/s）Fig.2 The cyclic voltammetry curves of the biosensor in 0.5 mmol/L acetylthiocholine chloride solution and in PBS.The scan rate is 0.1 V/s

2.2.2 抑制率曲线的测量

在0.5 V工作电压下，用传感器测定5×10-4mol/L硫代乙酰胆碱溶液的电流响应曲线，所得电流为基准电流i0。把制好的传感器在浓度分别为1.0、2.0、4.0 、6.0、10.0、15.0 mg/L 的甲胺磷溶液里浸泡12 min，分别测定其在相同浓度硫代乙酰胆碱溶液中的抑制电流ii。根据公式K=(ii-i0)/ii×100℅计算抑制率。抑制率-浓度关系曲线示于图3。有机磷的浓度越大，对酶的活性的抑制力就越强，加入相同浓度的乙酰胆碱溶液时产生的响应电流就越小。以有机磷农药浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标做图，则得到图3中的插图。可见当甲胺磷浓度在 1.0～15.0 mg/L范围内时，抑制率与浓度数值的对数呈线性关系，检测范围较文献值更宽[1]。图中直线部分的拟合线性方程为 y=11.8*ln(c)+44.8，r=0.992(n=6),方程中 c是以mg/L为单位的有机磷浓度。理论上的检测限是指10%的抑制率所对应的抑制剂浓度，因此可计算得到该传感器对甲胺磷的检测下限为0.05 mg/L。

图3 乙酰胆碱酯酶百分抑制率与甲胺磷农药浓度关系图(内置图为抑制率-浓度的对数关系图)Fig.3 Acetylcholinesterase percent inhibition vs Methamidophos concentrations incubated in phosphate buffer solution.Calibration graph of acetylcholinesterase percent inhibition vs.logarithm of concentration of Methamidophos is shown in the inset

为了研究传感器的工作机理，测定了不同扫描速度下传感器在硫代乙酰胆碱溶液中的循环伏安曲线（电压扫描范围为-0.4至0.8 V，扫描速度从 0.01 至 0.5 V/s），所得结果示于图 4A。 图中从最内圈的循环伏安曲线开始，所用的扫描速度分 别 是 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 V/s。

图4 (A)不同扫描速度下传感器在氯化硫代乙酰胆碱溶液(0.5 mmol/L)中的循环伏安曲线（电压扫描范围为 -0.4 至 0.8 V，扫描速度从内圈到外圈依次为 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 V/s）;(B)不同扫描速度下的循环伏安曲线的峰电流分别对扫描速度（ν）、扫描速度的1/2次方（ν1/2）及扫描速度的3/4次方（ν3/4）图Fig.4 (A)Cyclic voltammetry curves of AChE/CDP/CNT sensor in 0.5 mmol/L acetylthiocholine chloride solution at scan rates of:0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 V/s;(B)Fitting curves of peak current vs.(i)sweep rate(ν),(ii)the square root of sweep rate(ν1/2)and(iii)the three fourth power of sweep rate(ν3/4)

以各次循环伏安曲线的峰电流分别对ν、ν1/2及ν3/4做图，所得曲线示于图4B。根据已有研究结果，如果峰电流对扫描速度成正比，说明电极的电子传递过程受表面反应（电子转移）步骤控制；如果峰电流对扫描速度的1/2次方成正比，说明电极的电子传递过程受扩散步骤控制。 由图4B可见，在传感器电极上发生的电极反应与这两种情况都不符合，而是与扫描速度的3/4次方成正比。说明传感器的电子传递过程同时受表面反应和扩散两种电极反应机理控制。 通常固定化酶的电极反应都是由扩散控制机理起主要作用。据此可认为，由于碳纳米管的加入，缩短了酶与电极、底物与基础电极之间传递电子的途径，因而扩散步骤的影响减小，从而表现为二者混合控制的电极反应机理。这与纳米铂颗粒掺杂的生物传感器电子传递过程类似[14]。

3 结论

利用环糊精-预聚环糊精的混合溶液作分散剂来分散CNT，通过预聚环糊精的聚合反应制备出不溶于水的CDP-CNT复合膜，以其作为载体固定乙酰胆碱酯酶，得到了一种灵敏度较高、检测范围较宽的有机磷农药生物传感器。该传感器可以在 1.0～15.0 mg/L浓度范围内检测农药甲胺磷的含量，检测下限为0.05 mg/L。文中还探讨了该传感器的电极反应机理，表明电极的电子传递过程受电子转移步骤和扩散控制步骤两者共同作用。

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