超高效液相色谱法测定饲料中地昔尼尔

农业部畜禽产品质量安全检验测试中心（郑州） 方忠意 刘素梅

地昔尼尔别名丙虫啶，是一种体外杀虫剂，对双翅目昆虫和蚤有高度杀灭作用，可阻止各种蝇、蚊及蚤的幼虫发育成蛹和成虫。但是动物实验研究结果表明，地昔尼尔对实验动物鼠具有DNA氧化损伤和致癌作用（Matsumoto等，2009；Umemura等，2007；Moto 等，2006），很多国家已经制定了动物食品中的最大残留限量。最近发现有非法将地昔尼尔作为饲料添加剂用于饲料生产的现象，直接威胁到食品安全和我国的出口贸易，因此建立饲料中的地昔尼尔的检测方法，对打击非法使用药物、维护我国饲料和畜产品安全有重要的作用。目前国内外很少有地昔尼尔的检测方法的报道。本研究通过对地昔尼尔化学性质的分析和有关实验研究，建立了饲料中地昔尼尔的超高效液相色谱测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Lambda 35双光束紫外光谱仪；Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪 （带紫外检测器）；Heraeus离心机。

Waters Oasis MCX 萃取小柱 （3 mL，60 mg）。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵等均为色谱纯，其他试剂均为分析纯；水为超纯水。地昔尼尔对照品购自德国Dr公司（批号为60606）。

1.2 标准曲线溶液的配制 准确称取地昔尼尔标准品50 mg（精确至0.01 mg）于50 mL容量瓶中，加乙腈超声溶解，放冷至室温后用乙腈定容，配制成1.0 mg/mL的标准储备液；取适量的标准储备液， 用流动相配制成 0.05、0.1、0.5、1.0、10、50 μg/mL和 100 μg/mL系列标准工作液。

1.3 吸光度的扫描 用乙腈将地昔尼尔标准储备液稀释成浓度为10 μg/mL，用紫外分光光度计在200～500 nm扫描地昔尼尔的吸光度。

1.4 样品处理 准确称取（2.00±0.02）g已粉碎好的饲料样品，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋振荡20 min，12000 r/min离心10 min。取5 mL上清液于15 mL离心管中，于50℃下氮吹浓缩至近干后加入3 mL 20%甲醇溶液（含0.2%甲酸），涡旋溶解残渣，待净化。将Waters Oasis MCX固相萃取小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化后，加入待净化的溶液，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗后抽干，用3 mL 5%氨化甲醇洗脱，于50℃下氮吹浓缩至近干。准确加入1.0 mL 30%甲醇溶液溶解，涡旋混匀30 s，过0.22 μm滤膜，滤液供超高效液相色谱仪测定。

1.5 色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLCTMHSS T3柱（2.1 mm×100 mm i.d.，1.8 μm）；流动相：甲醇-10 mmol/L 乙酸铵溶液（30+70，V/V）；流速：0.3 mL/min。 检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；进样量：2 μL。

2 结果与讨论

2.1 吸收波长的选择 在200～500 nm波长范围内扫描地昔尼尔的吸光度曲线见图1。从吸光度曲线上可以看出，地昔尼尔有2个吸收峰，其最大吸收波长分别是222.60 nm和270.62 nm。虽然222.60 nm波长的吸光度高于270.62 nm的波长，但是饲料基质复杂，基质的吸收很容易影响地昔尼尔的检测，所以本研究的检测波长选择了270 nm。

图1 地昔尼尔的吸收曲线图

2.2 色谱条件的优化 实验过程中，比较Waters Acquity UPLCTMBEH C18柱 （2.1 mm×10 mm i.d.，1.7 μm） 和 Waters Acquity UPLCTMHSS T3柱（2.1 mm×100 mm i.d.，1.8 μm）发现，地昔尼尔在C18柱保留较差，色谱峰拖尾；但在T3柱有很好的保留，色谱峰对称性好。对甲醇和乙腈分别作为有机相时的分离效果进行比较，发现使用甲醇时地昔尼尔在色谱柱上保留较好；比较纯水、10 mmol/L乙酸铵溶液分别作为水相，发现使用10 mmol/L乙酸铵作为水相时的色谱图的基线噪音减小，色谱峰峰形得到改善。因此，实验最终采用“1.5”色谱条件，在该条件下得到的色谱图。由图2可知，在该色谱条件下，地昔尼尔色谱峰无杂质峰干扰。

2.3 固相萃取柱的选择 样品净化是对复杂基质样品检测过程中的一个重要步骤。从地昔尼尔的分子结构上可以分析出地昔尼尔是一种极性偏强的碱性化合物，实验过程中比较了C18、HLB和MCX三种不同类型的固相萃取柱的回收率，实验发现，C18柱的回收率相对较差，这可能是地昔尼尔极性偏强，在C18柱上保留较差；HLB和MCX柱的回收率基本相当，都达到95%以上，HLB柱能够保留极性化合物，MCX柱能够通过离子交换作用与地昔尼尔形成强有力的结合。考虑到MCX柱净化时专属性更强，净化效果更彻底，实验最终选择了MCX柱。

2.4 方法的线性范围、检出限、回收率与精密度取系列混合标准工作溶液，按质量浓度从低到高依次进样，以质量浓度和峰面积做回归曲线，得到地昔尼尔的回归方程为y=41231x-856，相关系数为0.9999，线性良好。在空白饲料样品中添加地昔尼尔标准溶液进行回收实验，方法检出限（S/N=3）为 0.05 mg/kg，定量下限（S/N=10）为0.1 mg/kg。

取地昔尼尔阴性的猪饲料样品，分别按样品中10、50 mg/kg和200 mg/kg的含量水平添加一定量的地昔尼尔标准溶液，每一水平做5个平行，按上述试样方法测定，回收率结果见表1。

3 小结

地昔尼尔质量浓度在0.05～100 μg/mL内线性关系良好，相关系数大于0.9999；在10～200 mg/kg的添加水平，平均加标回收率为78.0%～86.3%，相对标准偏差为4.2%～6.1%；方法的检出限低至0.05 mg/kg，定量下限低至0.1 mg/kg。该方法简单、快速、灵敏，可满足饲料中地昔尼尔的快速筛选检测的要求。

表1 地昔尼尔的回收率和精密度（n=5）

[1]Matsumoto S，Jin M，Dewa Y，etal.Suppressive effect of Siraitia grosvenorii extract on dicyclanil-promoted hepatocellular proliferative lesions in male mice[J].J Toxicol Sci，2009，34（1）：109 ～ 118.

[2]Moto M，Okamura M，Muguruma M，et al.Gene expression analysis on the dicyclanil-induced hepatocellular tumors in mice[J].Toxicol Pathol，2006，34（6）：744 ～ 51.

[3]Umemura T，Kuroiwa Y，Tasaki M，et al.Detection of oxidative DNA damage，cell proliferation and in vivo mutagenicity induced by dicyclanil，a non-genotoxic carcinogen，using gpt delta mice[J].Mutat Res，2007，633（1）：46～54.