HPLC测定天佛参口服液中蟾酥的含量

王芳，张秋萍，吴翰昱

（常熟雷允上制药有限公司，江苏 常熟 215500）

HPLC测定天佛参口服液中蟾酥的含量

王芳，张秋萍*，吴翰昱

（常熟雷允上制药有限公司，江苏 常熟 215500）

目的：建立HPLC同时测定天佛参口服液中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。方法：采用Waters SymmetryShieldTMRP18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈-0.5%磷酸二氢钾（38∶62）为流动相；检测波长为296 nm；流速为1.0 mL·min－1。结果：在建立的色谱条件下，华蟾酥毒基的回归方程为Y＝1 000 000X－648.2，r＝0.999 0，表明华蟾酥毒基在0.013 9～0.695μg与峰面积积分值呈良好线性关系；脂蟾毒配基的回归方程为Y＝5 000 000X＋42 394，r＝0.999 5，脂蟾毒配基在0.021 0～1.052 5μg与峰面积积分值呈良好线性关系。结论：本法简便、快捷，准确度高，专属性强，重现性好，可用于华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量测定。

HPLC；华蟾酥毒基；脂蟾毒配基；含量测定

天佛参口服液是常熟雷允上制药有限公司研发并已被批准生产的新品种，在含量测定中需要检测西洋参和蟾酥的含量，其中，检测蟾酥含量时，需要检测华蟾酥毒基和脂蟾毒配基两个成分。法定质量标准YBZ08752008中，采用高效液相色谱法测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，但其介绍的流动相在实际使用中分离度较差，重现性也不是很稳定。历来文献中也有对制剂中蟾酥含量测定的报道［1-2］，本文对天佛参口服液法定质量标准中的流动相进行了调整，对柱温进行调节，使华蟾酥毒基和脂蟾毒配基能够完全分离，且分离时间较合理。实验结果表明，本法简便、快捷，准确度高，专属性强，重现性好，可用于华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2487-1525-1500高效液相色谱仪。

1.2 试药

华蟾酥毒基对照品、脂蟾毒配基对照品（中国药品生物制品检定所）；天佛参口服液（自制，批号0911141，0911161，0911181）；磷酸二氢钾、氢氧化钠、三氯甲烷、无水硫酸钠、无水乙醇为分析纯；水为纯化水；甲醇、乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry ShieldTMRP18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相：乙腈-0.5%磷酸二氢钾（38∶62）；柱温：40℃；检测波长：296 nm；流速：1.0 mL·min－1；进样量：20μL。理论塔板数按华蟾酥毒基峰、脂蟾毒配基峰计算应分别不低于4 000，实际测量值分别为7 893，8 920。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的华蟾酥毒基对照品、脂蟾毒配基对照品各适量，加甲醇配制成每1mL含华蟾酥毒基10μg、脂蟾毒配基50μg的混合溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品25 mL，置分液漏斗中，加水25 mL，混匀，加三氯甲烷提取5次（30，30，30，20，20 mL），合并三氯甲烷液，用氢氧化钠溶液（0.1 mol·L－1）50 mL洗涤1次，弃去氢氧化钠液，再用水50 mL洗涤1次，弃去水液，三氯甲烷液用适量无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

按处方量，制备不含华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的空白样品，照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.5 系统适应性试验

分别取阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液各20μL，按照上述色谱条件进样测定，结果供试品溶液在与对照品溶液相同保留时间处有一致的色谱峰，阴性溶液在与对照品溶液相同的保留时间处无吸收峰，见图1。

图1 对照品及供试品HPLC图

2.6 线性关系考察

精密量取华蟾酥毒基和脂蟾毒配基混合溶液3 m L，置同一25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件，分别进样1，2，5，10，15，30，50μL，记录色谱图，计算峰面积，以峰面积积分值对进样量进行回归，求得回归方程，华蟾酥毒基：Y＝1 000 000X－648.2，r＝0.999 0，表明华蟾酥毒基在0.013 9～0.695μg与峰面积积分值呈良好线性关系；脂蟾毒配基：Y＝5 000 000X＋42 394，r＝0.999 5，脂蟾毒配基在0.021 0～1.052 5μg与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.7 稳定性试验

取样品溶液（0911141批），在0，4，12，18，24 h时分别进样5次，记录峰面积，样品溶液在24 h内稳定性良好，华蟾酥毒基成分与脂蟾毒配基成分的RSD分别为0.06%和0.31%。

2.8 精密度试验

取华蟾酥毒基和脂蟾毒配基对照品溶液，重复进样7次，记录峰面积，结果表明华蟾酥毒基和脂蟾毒配基精密度良好，RSD分别为0.10%和0.06%。

2.9 重复性试验

取0911141批样品，按上述色谱条件测定6次，样品中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总量为12.41μg·mL－1，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的RSD值分别为0.17%和0.15%。

2.10 回收率试验

分别精密量取样品（批号0911141）25 mL，共6份，分别精密加入对照品溶液（每1 mL含华蟾酥毒基0.011 6 mg，脂蟾毒配基0.042 1 mg）2，3，4 mL，混匀，加水至50 mL，混匀后，自“加三氯甲烷提取5次”始，按正文中拟定的方法测定，结果见表1，2。

表1 华蟾酥毒基回收率

表2 脂蟾毒配基回收率

2.11 样品含量测定

分别取3批样品，按上述方法测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，进行测定，结果见表3。

表3 天佛参口服液样品中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定 ／mg·（100mL）－1

3 讨论

3.1 流动相的选择

作者筛选了4种流动相系统，（1）甲醇-水（65∶35），（2）乙腈-水（50∶50）［3］，（3）乙腈－0.5%磷酸二氢钾溶液（50∶50）（用磷酸调节pH值为3.2）［4］，（4）乙腈－0.5%磷酸二氢钾溶液（38∶62）（用磷酸调节pH值为2.5），并对流动相的pH值进行了考察，结果第4种流动相系统分离效果好，峰形良好，且保留时间适中，故确定上述流动相系统为本法的流动相。

3.2 柱温的选择

通过在不同的柱温条件下进行试验，发现柱温40℃时分离度较好，分离时间适中，可保证在正常时间内完成检测任务。

3.3 提取次数的选择

在前期试验过程中，取批号为0911141的样品，按供试品溶液制备方法，分别以三氯甲烷提取3、4、5次，测定含量。样品提取3次的峰面积明显小于提取4、5次，而提取4次和5次的无明显差别。由此确定样品提取4次已基本提取完全，故提取次数定为4次。

本文用一个色谱系统同时测定两个组分的含量，具有简单、快捷、准确度高、专属性强、重现性好等特点。因此，可以使用本法用于天佛参口服液中蟾酥含量的质量控制。

［1］王京辉，金伟，金红宇，等.高效液相色谱法测定蟾酥中有效成分的含量［J］.中国中药杂志，1998，23（11）：651.

［2］纪玲，王清华，丛保忠，等.高效液相色谱法测定牛黄消炎片中酯蟾毒配基的含量［J］.中国实验方剂学杂志，1998，4（1）：2-4.

［3］罗虹，李文，孙丽燕，等.PHLC法测定蟾麝救心丸中蟾酥的含量［J］.光谱实验室，2005，22（3）：544.

［4］国家药典委员会.中国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：360.

Content Determination of Venenum Bufonis in Tianfushen Oral Solution by HPLC

Wang Fang，Zhang Qiuping，Wu Hanyu
（Changshu Leiyunshang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Changshu Jiangsu215500）

Objective：To establish a HPLCmethod to determine the contents of cinobufagin and resibufogenin for chief components of venenum bufonis in tianfushen oral solution.Methods：The method were determined by HPLC with Waters Symmetry ShieldTMRP18（4.6 mm×250 mm，5μm）as column，amixture of acetonitrile：0.5%potassium dihdyrogen phosphate（38∶62）asmobile phase，UV detector at 296nm and flow rate of 1.0mL·min－1.Results：The calibration curves are linear in the range of 0.013 9～0.695μg for cinobufagin（r＝0.999 0），0.021 0～1.052 5μg（r＝0.999 5）for resibufogenin，respectively.regression equations wereY＝1 000 000X－648.2 andY＝5 000 000X＋42 394，respectively.Conclusion：The method is simple，rapid and accurate，which can be used to determine chief components of venenum bufonis in tianfushen oral solution.

HPLC；Cinobufagin；Resibufogenin；Content determination

*张秋萍，E-mail：zqp922＠sina.com

2010-03-01）