植物类型III聚酮合酶超家族基因结构、功能及代谢产物

马兰青，师光禄，叶和春，刘本叶，王有年

1 北京农学院 农业部都市农业 (北方) 重点开放实验室，北京 102206

2 中国科学院植物研究所 中国科学院光合作用与环境分子生理学重点实验室，北京 100093

综 述

植物类型III聚酮合酶超家族基因结构、功能及代谢产物

马兰青1，师光禄1，叶和春2，刘本叶2，王有年1

1 北京农学院 农业部都市农业 (北方) 重点开放实验室，北京 102206

2 中国科学院植物研究所 中国科学院光合作用与环境分子生理学重点实验室，北京 100093

植物聚酮类化合物主要包括酚类、芪类及类黄酮化合物等，在植物花色、防止紫外线伤害、预防病原菌、昆虫危害以及作为植物与环境互作信号分子方面行使着重要的生物学功能。该类化合物具有显著多样的生物学活性，对人体保健及疾病治疗有显著意义。植物类型III 聚酮化合物合酶 (PKS) 在该类化合物生物合成起始反应中行使着关键作用，决定该类化合物基本分子骨架建成和代谢途径碳硫走向，为合成途径关键酶和限速酶。以查尔酮合酶为原型酶的植物类型III PKS超家族是研究系统进化和蛋白结构与功能关系的模式分子家族，目前已经分离得到14种植物类型IIIPKS基因，这些同祖同源基因及其表达产物既有共性，也表现出许多独特个性，这些个性赋予此类次生代谢产物结构上的多样性。以下综述了植物类型III PKS超家族基因结构、功能及代谢产物研究进展。

聚酮合酶，查尔酮合酶，次生代谢

Abstract:Plant-specific type III polyketide synthase (PKS) produces a variety of plant secondary metabolites with notable structural diversity and biological activity. So far 14 plant-specific type III PKS have been identified according to their enzymatic products, and the corresponding genes have been cloned and characterized. The differences among the various PKS are mainly in their substrate specificities, the number of their condensation reactions, and the type of ring closure of their products. However,numerous studies have revealed the common features among the plant-specific type III PKS, which include sequence homology,similar gene structure, conserved amino acid residues in the reaction center, enzymatic characteristics and reaction mechanism. We briefly reviewed 14 plant-specific type III PKS to better understand genetic and metabolic engineering of plant-specific type III PKS.

Keywords:polyketide synthase, chalcone synthase, secondary metabolism

聚酮类化合物 (Polyketide，PK) 是由细菌、真菌、放线菌及植物产生的一大类次生代谢产物，主要包括大环内酯类、四环素类、蒽环类、聚醚类、酚类、芪类以及类黄酮化合物等。由于生物合成途径及机制复杂多变，造成聚酮化合物数量和分子结构极其庞大繁杂，从而使该类化合物具有显著多样的生物学活性。微生物来源的聚酮化合物家族包括了大多数抗生素和一些重要药物 (抗癌药、免疫抑制剂等)。如临床上已经应用的红霉素、四环素、利福霉素、两性霉素、阿霉素、洛伐他丁、FK506、雷帕霉素等重要抗生素，以及农牧业上使用的阿弗菌素和莫能星、泰乐菌素等都属于这个家族[1]。植物聚酮类化合物主要包括酚类、芪类以及类黄酮化合物等，其中，众多化合物具有抗肿瘤、心血管保护、抗氧化功能[2-3]。目前，来源于聚酮化合物的药物每年销售额已超过100亿美元。

聚酮化合物虽然种类繁多、结构多变，但其生物合成有着共同的机制，均由聚酮化合物合酶(Polyketide synthase，PKS) 催化合成。目前发现的PKS大体上可分为3类：I型PKS是以模块形式存在的多功能酶，每一模块含有一套独特的、非重复使用的催化功能域，主要催化合成大环内酯、聚烯及聚醚类化合物；II型PKS是含有一组可重复使用单元的多酶复合体，主要催化芳香族聚酮化合物的生物合成，I型和II型PKS主要存在于微生物中；III型PKS属于查尔酮合成酶 (Chalcone synthase，CHS) (EC 2.3.1.74) 类，主要存在于植物和细菌中，是一种可重复使用的同源双亚基蛋白，主要负责单环或双环芳香类聚酮化合物的生物合成[1]。本文主要针对植物类型III PKS超家族基因结构、功能及代谢产物进行分析。

1 植物类型III PKS超家族成员

CHS普遍存在于植物中。1972年，CHS的体外酶促活性首次在欧芹悬浮细胞培养物中被发现[4]。1983年首个CHS的基因序列从欧芹中被克隆[5]。漫长的进化过程中，CHS基因在不同植物谱系中发生了不同程度的重复和分化，导致在多数植物基因组中存在具不同表达特性的CHS重复基因，并在部分植物基因组中出现由CHS基因分化形成的具有新的底物选择性和产物特异性的“类CHS(CHS-Like)”基因[6]。这些结构相似、功能相关、但表达模式及编码产物催化特性有一定差异的基因组成了一个庞大的基因家族——查尔酮合酶基因超家族 (Chalcone synthase superfamily)，又称为植物类型III PKS基因超家族 (Plant-specific type III polyketide synthase superfamily)。

目前，已经从苔藓、蕨类、裸子和被子植物中分离了14种植物类型IIIPKS基因。这些不同PKS的差别主要体现在起始底物特异性、缩合反应次数(聚酮链延伸长度) 以及产物合成所使用的不同环化方式等。这些PKS的名称、催化方式见表1。以细菌类型III PKS为外类群的系统发育分析结果表明，植物类型III PKS按照苔藓、蕨类，裸子和被子植物分类，每一类型植物中的 CHSs和功能异化的类型III PKS (CHS-like) 分别构成独立的组群 (图1)[10]。

2 植物类型III PKS超家族基因结构

植物类型 III PKS超家族不同成员具有许多共同特征，主要包括基因结构、序列相似性、活性中心、酶学性质以及共同的催化机制等[6-7]。保守的基因结构是高等植物类型IIIPKS的一个共同特征。显花植物 (裸子植物和被子植物) 中，除一个早期报道的金鱼草Antirrhinum majusCHS(AMCHS) 含有2个内含子 (Intron) 外[7]，迄今20余年研究中，所有报道的类型IIIPKS基因均含有1个内含子且该内含子位置保守[3,8]。金鱼草AMCHS两个内含子中，第一内含子的位置与其他基因相同，第二内含子位于第二个外显子 (Exon) 内部，Sommer和 Saedler[7]推测第二内含子是在金鱼草这一物种形成后获得的。然而作者及后续的研究并未对AMCHS的基因特性、表达特性及 AMCHS酶学性质，具体功能作进一步的研究，也没有金鱼草及其相关科属植物中类型IIIPKS超家族其他成员基因结构方面的报道。

有趣的是，在我们工作中2个含有3个内含子的类型IIIPKS基因 (PcPKS1，经系统发育和功能研究证明其编码产物为具有双酶活性的 CHS；PcPKS2，经过分析确认其编码产物为苯亚甲基丙酮合酶，Benzalacetone synthase，BAS) 相继从虎杖Polygonum cuspidatumSieb. et Zucc中被分离和鉴定，3个内含子在上述 2个基因中的插入位置完全保守[9-10]。与PcPKS1和PcPKS2内含子2相比，金鱼草AMCHS第二个内含子的插入位置相对保守，向前移动了一个碱基[9-10]。PcPKS1和PcPKS2的 3个内含子之间没有发现显著的相似性[9-10]。迄今为止，CHS是高等植物中最共同和分布最广泛的类型IIIPKS，所有已经得到功能验证的植物类型IIIPKS超家族其他成员 (CHS-like) 都来自于CHS广泛重复和后续的遗传变异[2]。除了PcPKS1和PcPKS2，我们进一步的工作发现在虎杖中存在一个含有 1～2个内含子基因组成的植物类型IIIPKS基因家族。其中包括一个单内含子CHS基因 (EU647246)、一个单内含子CHS-like基因 (DQ459349)、一个双内含子CHS-like基因 (EU647245)。考虑到PcPKS1和PcPKS23个内含子保守的插入位点以及系统发育分析结果 (图 1)，我们推测虎杖中PcPKS2极有可能通过一个单基因重复事件从一个 3内含子CHS(PcPKS1) 进化而来[10]。隐花植物中，新近一项研究也发现了植物类型IIIPKS超家族特殊的基因结构，新型模式植物小立碗藓Physcomitrella patens假定的19个类型 IIIPKS基因中，有 6个不含内含子，4个含有1个内含子，而剩余的基因含有2个内含子[11]。苔藓植物大约在 4.5亿年前从维管植物的祖先中分离出来[11]，因此类型IIIPKS非正常的基因结构在显花植物和隐花植物中都是存在的。植物β-酮酯酰合酶 (β-ketoacyl synthases，KS) 被认为是植物类型 III PKS的祖先，大部分的β-酮酯酰合酶在其编码区不含内含子[12]。目前，还没有类型IIIPKS基因内含子功能方面的报道。然而一些研究表明，内含子对于植物基因的功能是有作用的[13]。近些年来，虽然类型III PKS的家族成员不断从各种植物中被鉴定，但对该家族基因的基因组分布状况知之甚少。植物类型 III PKS在基因组水平上复杂的进化变化极有可能是不断适应产生具有植物种属特性化学信号的结果。因此非正常的基因结构也极有可能存在于那些已经经过功能鉴定的类型 IIIPKS超家族其他成员(CHS-like) 基因中。进一步的工作需要阐明植物类型 IIIPKS多内含子基因结构在高等植物中的分布状况。

表1 植物类型III PKSs超家族成员Table 1 Plant-specific type III polyketide synthase superfamily

图1 植物类型III PKS超家族成员系统发育分析结果 (以细菌类型III PKS为外类群，用于系统发育分析的基因序列接收号及分析方法见文献[10])Fig.1 Neighbor-joining tree of type III PKS. Numbers at the forks are bootstrap values from 100 replicates. Four bacterial type III PKS were used to root the tree. The accession numbers used in the analysis were as previously described[10].

3 植物类型III PKS超家族酶功能及其次生代谢产物

植物类型 III PKS超家族成员底物选择和催化机制非常复杂，主要体现在 3个方面：一是超家族中不同酶有不同的主产物；二是家族中的很多成员都有着非常宽泛的起始底物特异性；三是体外酶促反应中，会产生相当数量的早期脱轨产物——副产物，如 2步缩合反应丙烯酮-中间体副产物Bisnoryangonin (BNY)，3步缩合反应丁烯酮-中间体副产物4-Coumaroyltriaceticacid lactone (CTAL)，在特定条件下，副产物的量有时会超过主产物的量。植物聚酮类化合物主要包括酚类、芪类以及类黄酮化合物等。其中，大部分聚酮类化合物生物合成途径机制尚不明确，但可以肯定的是植物类型III PKS在聚酮化合物生物合成起始反应中行使着关键的作用，决定着化合物基本分子骨架的建成和代谢途径碳硫走向，是植物聚酮化合物生物合成途径的关键酶和限速酶。作为重要的植物次生代谢产物，植物聚酮类化合物及其衍生物在植物色彩、防止紫外线伤害、预防病原菌、昆虫危害以及作为植物与环境之间互作的重要信号分子方面行使着重要的生物学功能。

植物类型III PKS超家族中，目前研究最为透彻的是查尔酮合酶，其催化来自丙二酰辅酶 A(Malonyl-CoA) (类型III PKS“延伸”底物) 的3个乙酰集团通过连续的缩合反应连接到 4-香豆酰辅酶A (p-Coumaroyl-CoA) (类型 III PKS“起始”底物) 分子上，之后通过克莱森 (Claisen) 型环化反应生成芳香族聚酮化合物柚皮素查尔酮 (Naringenin chalcone)，其为类黄酮化合物生物合成的前体(图 2) 。类黄酮化合物广泛存在于高等植物中，在植物体内绝大部分以糖甙的形式转运和贮存[14]，与植物的花色形成密切相关，并在植物与环境的相互作用中起重要作用，如防止紫外线 (UV) 损伤、抗虫、抗病、影响豆科植物的根瘤形成等[2-3]。众多研究结果表明，查尔酮衍生物 (即类黄酮化合物) 对人体健康和疾病治疗具有积极效果[2-3]。

植物类型 III PKS超家族的酶都是由分子量为40～45 kDa大小适中亚基组成的同型二聚体，活性位点为 Cys164、His303和 Asn336，这 3个在植物类型 III PKS超家族中绝对保守的氨基酸组成了该类酶的活性中心 (三联体活性中心)：“起始底物分子结合结构域”和“环化反应结构域”。紫花苜蓿Medicago sativaCHS晶体结构和定点突变的研究结果揭示了CHS催化柚皮素查尔酮形成机制和过程：1) 起始分子定位于 Cys164位点；2) 丙二酰-CoA脱羧生成乙酰-CoA；3) 聚酮化合物链开始延伸；4)丁烯酮-中间体-CHS复合物完成环化和芳构化[15]。此外，CHS活性位点还包括Val98、Thr132、Ser133、Met137、Gly163、Thr194、Gly211、Gly216、Ile254、Ser338、Pro375，以及CHS“门卫”氨基酸Phe215和 Phe265[2]。植物类型 III PKS超家族其他成员酶(CHS-Like) 功能的多样性来自原型酶——CHS活性位点的小的修饰，这些小的变动改变了起始底物的选择性、链延伸的长度和环化反应机制 (表1、图2)。

3.1 苯亚甲基丙酮合酶 (BAS)

苯亚甲基丙酮合酶 (BAS) 使用与CHS相同的底物，但产物却存在很大差异。掌叶大黄Rheum palmatumBAS一个显著特点是 Phe215 (M. sativaCHS顺序)被Leu取代，定点突变实验结果表明，这个位置上的取代对于该酶的BAS活性是必需的，该位置上 Phe被替换，致使聚酮链的延伸在乙烯酮中间体阶段即被打断 (表1、图2)[16]。Austin和Noel[2]认为CHS“门卫”Phe、Phe215和Phe265可能调节类型III PKS活性位点与辅酶A (CoA) 结合通道之间的空间结构。我们的研究证实，PcPKS2同样是一个 BAS，有趣的是，Phe215和 Phe265在 PcPKS2中双双缺失，分别被Leu和Cys取代，导致聚酮链的延伸在乙烯酮中间体阶段提前结束 (图2)。另一个非常有趣的结果同样出现在我们的研究中，经序列及系统发育分析表明，PcPKS1是一个典型的CHS，然而，功能和酶学分析结果显示 PcPKS1是一个同时拥有 CHS和 BAS活性的双功能酶，且PcPKS1的 BAS活性催化效率 (Kcat/Km) 比PcPKS2高70倍[10]。BAS在构建具有重要药理价值一系列苯丁烷类化合物 (Phenylbutanoids) 及其衍生物的 C6–C4分子骨架方面具有重要的功能。目前这些苯丁烷类化合物主要包括大黄中的林氏莲花掌素甙 (Glucoside lindleyin)、生姜中的姜酚(Gingerol) 和姜黄 (Curcumin)[17]，以及覆盆子果实中一种独特的芳香物质覆盆子酮 (Raspberry ketone)[17]。

3.2 4-香豆酰甘油酸合酶 (CTAS)

八仙花Hydrangea macrophyllavar.thunbergii4-香豆酰甘油酸合酶 (p-Coumaroyl triacetic acid synthase，CTAS) 催化4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A分子间3步连续的缩合反应，但CTAS缺乏必要的环化机制，导致其催化产物为线性丁烯酮中间体副产物——CTAL[18](表1、图2)。序列分析显示，在CTAS中，CHS活性位点Thr197被Asp取代，同时在相当于M. sativaCHS第290位氨基酸残基位置上有6个氨基酸残基的插入[2]。CTAS产物CTAL的衍生物Hydramacroside B存在于八仙花叶片中，是一种重要的植物抗毒素[19]。

3.3 芪合酶 (STS)

芪合酶 (Stilbene synthase，STS) 能够利用与CHS相同的底物催化合成相同的丁烯酮-中间体产物，然而后续步骤中，二者环化反应机制存在差异，CHS运用分子内克莱森型缩合反应机制催化丁烯酮-中间体分子C6和C1位置进行缩合连接生成柚皮素查尔酮；而 STS则运用分子内醛醇缩合 (Aldol condensation) 反应机制催化丁烯酮-中间体分子 C7和 C2位置进行缩合连接生成白藜芦醇(Resveratrol)，且伴有 C1位置脱羧反应 (表 1、图2)。后续研究显示，STS与CHS之间具有显著的序列相似性[20]，除不同的环化反应机制外，二者之间没有发现其他反应机制的差别[21]。随着STS从松树(裸子植物)[22]和葡萄 (被子植物)[23]相继克隆促进了STS与CHS之间的系统发育分析，结果显示二者在氨基酸水平存在60%～90%的同一性，在34个CHS和4个STS的系统发育分析中，STS没有单独聚合，而是与相同或相关植物的CHS聚合，该研究结果说明 STS从 CHS多次进化而来。有趣的是，将花生Arachis hypogaeaSTS和野葛Pueraria lobataCHS cDNA分别在大肠杆菌中表达，它们的表达产物存在着部分重叠，即在 CHS催化产物中有白藜芦醇(约为柚皮素查尔酮的2.7%～4.2%)，而在STS催化产物中含有有柚皮素查尔酮 (约为白藜芦醇量的1.4%～2.3%)[24]。被子植物STS产物白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，是在植物受到病原性进攻和环境恶化时产生的一种植物抗毒素，广泛存在于种子植物中。花生、葡萄的STS在烟草、苜蓿中异源过表达后，上述两种植物的抵抗真菌能力显著增强[25]。白藜芦醇不仅是一种重要的植物抗毒素，还具有众多的药理和保健功能，主要包括：抗癌作用；心血管保护作用；抗氧化、抗自由基作用；神经保护作用；消炎作用；抗真菌作用；机体损伤的保护作用；植物雌激素作用；对骨代谢和内皮素拮抗剂的影响等。其中，最令人瞩目和具有发展前景的是其在抗肿瘤、心血管保护、抗氧化方面的作用[26]。裸子植物 STS由于使用不同的起始底物肉桂酰辅酶A (Cinnamoyl-CoA)，其产物为银松素 (Pinosylvin)，也是一种重要的植物抗毒素。

3.4 联苄合酶 (BBS)

联苄合酶 (Bibenzyl synthase，BBS) 的催化方式与STS完全相同，只是起始底物有所差异。BBS使用联苄-m-香豆酰辅酶 A (dihydro-m-Coumaroyl-CoA) 为起始底物，催化来自丙二酰辅酶A的3个乙酰集团通过连续的缩合反应连接到起始底物分子上，并运用分子内醛醇缩合反应机制催化中间体分子 C7和 C2位置进行缩合连接生成联苄-芪产物(Dihydrostilbene)——3,3'5-Trihydroxybibenzyl，且伴有 C1位置脱羧反应 (表 1、图 2)[27]。基于 BBS序列结构的实验结果显示，CHS保守位点 Met137、Val98和Gly211分别被Leu、Ala和Thr取代有可能直接影响BBS起始底物的选择性[2]。在胁迫或伤处理兰花组织时，特别是伤口感染内生菌根菌的情况下，联苄-芪类化合物及其三环衍生物——9,10-Dihydrophenanthrenes开始大量积累，推测联苄化合物为一种植物抗真菌植保素[2]。

3.5 芪-羧酸酯合酶 (STCS)

芪-羧酸酯类化合物存在于八仙花属(Hydrangea)、苔类 (Liverworts)、大麻类植物(Cannabis) 以及毒常春藤 (Poison ivy) 中，它们中的许多化合物拥有非常有价值的特性，如叶甜素(Phyllodulcin) 的甜味超过蔗糖600～800倍[28]。从该类化合物分子结构判断，其前体极有可能起源于类型III PKS的催化，然而在体外环境下，至今没有该类化合物完整的合成途径得到确认和证明[2]。但在上述植物中，不断有催化该类反应新的类型III PKS被验证。例如，八仙花Hydrangea macrophylla芪-羧酸酯合酶 (Stilbenecarboxylate synthase，STCS)的催化方式与STS、BBS的差别主要体现在最适起始底物和脱羧反应机制上，STCS以联苄-4-香豆酰辅酶A (Dihydro-4-Coumaroyl-CoA) 为起始底物，催化来自丙二酰辅酶A的3个乙酰集团通过连续的缩合反应连接到起始底物分子上，并运用分子内醛醇缩合反应机制催化中间体分子C7和C2位置进行缩合连接生成5-Hydroxylunularic acid，值得关注的是，其C1位置未发生脱羧反应 (表1、图2)[29]。

3.6 吖啶酮合酶 (ACS)

芸香科植物 (Rutaceae) 具有三环结构吖啶酮分子的基本骨架是由吖啶酮合酶 (Acridone synthase ACS) 催化合成的。ACS催化来自丙二酰辅酶A的3个乙酰集团通过连续的缩合反应连接到特异起始底物 N-甲基邻氨基苯 (甲) 酰辅酶 A(n-Methylanthraniloyl-CoA) 分子上，之后通过克莱森 (Claisen) 型环化反应生成吖啶酮化合物——1,3二甲基-N-甲基吖啶酮 (1,3-dihydroxy-N-methylacridone) (表1、图2)[30]。芸香科植物不论是CHS还是STS在体外条件下都不能利用N-甲基邻氨基苯 (甲) 酰辅酶A作为起始底物，而野生型的ACS却可以利用4-香豆酰辅酶A合成柚皮素查尔酮，其活性是以N-甲基邻氨基苯 (甲) 酰辅酶A为起始底物的15%[31]。像其他类型III PKS一样，ACS氨基酸序列中有近 100处与 CHS有所差异，其中 ACS三联体突变体 (T132S/S133A/F265V) 能够明显降低ACS利用N-甲基邻氨基苯(甲)酰辅酶A为起始底物的能力，却能够显著增加对4-香豆酰辅酶A的亲和性[32]，这3个氨基酸对于ACS相对于CHS的活性变化非常重要，然而，ACS三联体突变体 (T132S/S133A/F265V) 仍然能保持一定吖啶酮合成能力的事实说明，仍然有其他一些重要的位点对于ACS功能有作用[32]。目前已知的近百种吖啶酮生物碱大部分特异地分布在芸香科植物家族中，近期也有报道在胡椒科 (Piperaceae) 植物中发现了这类化合物[30]。该类化合物属于生物碱植物抗毒素，同时具有许多诱人的生物学活性，但由于其干扰DNA合成，其在医学治疗方面的作用受到限制[33]。

3.7 二苯甲酮合酶 (BPS) 和联苯合酶 (BIS)

我们对二苯甲酮合酶 (Benzophenone synthase，BPS)[34]和联苯合酶 (Biphenyl synthase，BIS)[35]酶学性质及功能研究结果表明，BPS和BIS之间的功能关联与CHS和STS之间的关系完全相同，只是起始底物有所差别。CHS和STS使用4-香豆酰辅酶A，而BPS和BIS使用苯甲酰辅酶A (Benzoyl-CoA) 为起始底物。BPS催化来自丙二酰辅酶A的3个乙酰集团通过连续的缩合反应连接到苯甲酰辅酶A分子上，之后通过克莱森型环化反应机制生成Phlorbenzophenone。而BIS则能够利用与BPS相同的底物催化合成相同的中间体产物，后续环化反应中，BIS运用分子内醛醇缩合 (Aldol condensation) 反应机制生成3,5-二羟基联苯 (3,5-Dihydroxybiphenyl)，且伴有C1位置脱羧反应 (表1、图2)。BPS是合成苯甲酮 (Benzophenones) 和 (夹) 氧二苯甲酮(Xanthones) C13基本骨架的关键酶，苯甲酮衍生物为天然酚类化合物，具有诱人的药理学特性，如Guttiferone F具有很强的抗HIV和抗微生物活性[36]。BIS是合成联苯化合物 (Biphenyls) 的起始酶[35]。联苯化合物是蔷薇科 (Rosaceae) 苹果亚科(Maloideae) 中一类植物抗毒素，且具有明显的种属特性[37]。该类植物包括了温带常见的观赏和食用植物，如苹果、梨及花楸、山楂等。

3.8 2-吡喃酮合酶 (2-PS)

2-吡喃酮合酶 (2-PS) 克隆于观赏雏菊Gerbera hybrida。与 CHS不同，2-PS不能利用 4-香豆酰辅酶A，而是利用乙酰辅酶A (Acetyl-CoA) 作为起始底物，其催化来自丙二酰辅酶A的2个乙酰集团通过连续的缩合反应连接到乙酰辅酶A分子上，之后通过内酯化 (Lactone) 反应生成6-甲基-4羟基-2-吡喃酮 (6-methyl-4-hydroxy-2-pyrone) (表 1、图 2)[37]。在不含乙酰辅酶A的体外酶促体系中，2-PS也可以利用丙二酰辅酶A脱羧后的乙酰辅酶A作为起始底物，只是催化效率下降10倍。以g2ps1为探针，一系列相似酶从观赏雏菊和其他 4个菊科植物中被克隆。与CHS序列比对结果表明，在被子植物菊科家族产生进化分化之前，2-PS亚家族极有可能通过一个单基因重复事件从一个CHS进化而来[38]。基于紫花苜蓿M. sativaCHS晶体结构同源模拟结果显示，与 CHS相比，2-PS的催化腔体积较小[39]。定点突变研究结果表明，CHS三联体突变体(T197L/G256L/S338I) 的功能与2-PS完全相同[40]。2-PS为2种含有还原型甲基吡喃酮基本骨架的化合物 (Gerberin和parasorboside) 提供了前体，这两种化合物的糖甙及其衍生物存在于多种植物中，具有很好的抑制细菌、真菌和预防昆虫摄食的作用[37]。体外酶促反应中，2-PS可以利用苯甲酰辅酶 A(Benzoyl-CoA) 为起始底物产生 6-苯基-4-羟基-2-吡喃酮 (6-phenyl-4-hydroxy-2-pyrone)，该化合物结构符合 HIV-1蛋白酶抑制剂家族基本特征，可能具有潜在的功能[37]。

3.9 芦荟松合酶 (ALS)

掌叶大黄R. palmatum芦荟松合酶 (Aloesone synthase，ALS) 同样以乙酰辅酶A为起始底物，以丙二酰辅酶A为延伸底物，值得关注的是，ALS催化2个底物间6步连续的缩合反应，中间产物经环化产生芳香族庚烯酮——芦荟松 (Aloesone) (表1、图2)[15]。ALS与CHS保持有60%的氨基酸序列同一性，并且保有几乎所有的辅酶A结合位点，但在ALS中，CHS活性位点Thr197、Ile254、Gly256和Ser338分别被Ala、Met、Leu和Thr所取代，有意思的是这些氨基酸残基在2-PS中同样被取代[41]。基于紫花苜蓿M. sativaCHS晶体结构同源模拟结果显示，ALS具有与CHS相同的三维结构，但ALS催化腔体积 (1173 Å3) 要明显大于CHS (1019 Å3) 和2-PS (298 Å3)，此结果暗示着活性中心三维空间体积有可能决定着聚酮化合物链延伸的长度。ALS在大黄 (Rhubarb) 中的产物，如 AloesoneO-glucoside(7-O-β-D-glucopyranoside) 和 AloesoneC-glucoside(8-C-β-D-glucopyranoside) 具有很强的消炎活性[15]。

图2 植物类型III PKSs超家族成员催化反应过程及产物 (环化反应类型及位置在图中标出，反应机制见表1参考文献)Fig.2 Comparison of the reactions and products of known divergent plant type III PKSs. The position and type of cyclization reaction (Claisen, aldol, or lactone) of each presumed linear polyketide intermediate is depicted. The reaction mechanism of plant-specific type III PKSs was as described in the references of Table 1.

3.10 苯戊酮合酶 (VPS)

啤酒花 (Humulus lupulus，hops) 苯戊酮合酶(Valerophenone synthase，VPS) 以脂肪酰辅酶A——异戊酰基或异丁酰基辅酶 A (Isovaleryl-或 Isobutyryl-CoA) 为起始底物，以丙二酰辅酶 A为延伸底物，催化2个底物间3步连续的缩合反应，中间产物经克莱森型环化反应生成 Phlorisovalerophenone或Phlorisobutyrophenone。有趣的是，在体外酶促反应中，CHS可以接受异戊酰基-CoA为起始底物，其产物为 Phlorisovalerophenone和一个丙烯酮内酯副产物的混合物，而VPS却不能利用CHS香豆酰辅酶A作为起始底物[42]。VPS与CHS氨基酸序列比对结果表明，二者在邻近CHS“起始底物结合结构域”周围存在许多有意思的差异，CHS中保守的 Thr132和Thr197，在啤酒花VPS中分别被Gly和Ile取代。第 2个 VPS发现于原始维管植物松叶蕨Psilotum nudum中，其在132和197位置上都为Ser，且CHS和啤酒花VPS中保守的Ser338在松叶蕨VPS中被Val取代[2]。VPS在啤酒花中的代谢产物，一系列苦味酸物质，如蛇麻烯 (Humulone) 和蛇麻酮(Lupulone) 赋予啤酒独特的口味[2]。

3.11 戊烯酮-色酮合酶 (PCS) 和辛烯酮合酶(OKS)

戊烯酮-色酮合酶 (Pentaketide chromone synthase，PCS) 能够催化丙二酰辅酶 A分子间连续 4步的缩合反应产生 5,7-dihydroxy-2-methylchromone[43]，而辛烯酮合酶 (Octaketides synthase，OKS) 则可以催化丙二酰辅酶A分子间连续7步的缩合反应产生芳香族辛烯酮产物——Octaketides SEK4和SEK4b[44]。序列比对结果显示，OKS与植物类型III PKS超家族其他成员酶保持有50%～60%的氨基酸序列同一性，与 ALS、PCS及 2-PS相同，CHS活性位点Thr197、Gly256和 Ser338分别被其他氨基酸所取代。同源模拟结果显示，OKS的催化腔体积为(1124 Å3)，适合其完成连续7步的缩合反应。日本芦荟Aloe arborescensPCS为平喘药 Kehellin和Visnagin生物合成提供了前体化合物[43]；而来自相同植物的OKS可能为抗生素类药物辛烯酮提供了前体化合物[44]。

4 总结和展望

植物类型 III PKS超家族成员功能多样性和底物特异性的冗杂是这个研究领域内公认的。超家族内其他成员酶 (CHS-Like) 功能的多样性均来自其原型酶——CHS活性位点的小的修饰，这些小的变动影响了该类酶活性中心空间构象，这种空间变化极大改变了酶分子的起始底物选择性、链延伸长度和环化反应机制。因此，揭示植物类型III PKS超家族结构与功能间的关联，对于利用该类酶进行基因工程、代谢工程遗传操作是不可或缺的。

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Plant-specific type III polyketide synthase superfamily:gene structure, function and metabolistes

Lanqing Ma1, Guanglu Shi1, Hechun Ye2, Benye Liu2, and Younian Wang1

1Key Laboratory of Urban Agriculture(North)of Ministry of Agriculture China,Beijing University of Agriculture,Beijing102206,China
2Key Laboratory of Phytosynthesis and Environmental Molecular Physiology,Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Beijing100093,China

Received:January 19, 2010;Accepted:June 18, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 30170759, 30571506), Beijing Municipal Natural Science Foundation (No. 6071001),Funding Project for Academic Human Resources Development in Institutions of Higher Learning under the Jurisdiction of Beijing Municipality (Nos.PXM2007-014207-044536, PXM2007-014207-044538).

Corresponding author:Benye Liu. Tel: +86-10-62836244; Fax: +86-10-62836249; E-mail: benyel@ibcas.ac.cn

Younian Wang. Tel/Fax: +86-10-80799006; E-mail: lqma@bac.edu.cn

国家自然科学基金项目 (Nos. 30170759, 30571506)，北京市自然科学基金重点项目 (No. 6071001)，北京市属高校人才强教计划 (Nos.PXM2007-014207-044536, PXM2007-014207-044538) 资助。