利用大肠杆菌工程菌廉价高效生产聚羟基丁酸酯

魏国清，陈泉，康振，祁庆生

1 山东大学 微生物技术国家重点实验室，济南 250100

2 江西农业大学理学院，南昌 330045

代谢工程

利用大肠杆菌工程菌廉价高效生产聚羟基丁酸酯

魏国清1,2，陈泉1，康振1，祁庆生1

1 山东大学 微生物技术国家重点实验室，济南 250100

2 江西农业大学理学院，南昌 330045

利用大肠杆菌生产聚羟基脂肪酸酯是近来国际上生物可降解塑料的研究热点，本研究通过对适宜于聚羟基脂肪酸酯生产的大肠杆菌菌株的选择和碳源利用试验，初步确立了大肠杆菌代谢工程改造生产聚羟基脂肪酸酯的基础。并在此基础上，通过对大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖转移酶系统的改造和工程菌环境诱导系统的应用，解决了大肠杆菌工程菌无法同时利用多种碳源合成聚羟基脂肪酸酯的难题。发酵试验证明，工程化改造的大肠杆菌利用廉价底物在5 L 发酵罐中分批培养32 h后，菌体终浓度能够达到8.24 g/L，聚羟基脂肪酸酯占细胞干重的84.6%。

大肠杆菌，聚羟基脂肪酸酯，可降解塑料，发酵

Abstract:Based on the fermentation analysis ofEscherichia colistrains and cheap renewable resources suitable for polyhydroxybutyrate (PHB) production, we constructed aptsGmutant ofEscherichia coliDH5α. Application ofE. coliDH5α mutant together with stress-induced system, we could produce PHB efficiently from cheap renewable sugar mixture by the simultaneous consumption of different sugars. Batch fermentation at lab scale (5 liter) showed thatE. coliDH5α ΔptsG/pQKZ103 produced PHB from sugar mixture up to 84.6% of cell dry weight in 32 hours; meanwhile, the cell dry weight reached 8.24 g/L.

Keywords:Escherichia coli, PHB, biodegradable plastics, fermentation

聚羟基脂肪酸酯 (Polyhydroxyalkanoates，PHA)是微生物在不平衡生长条件下形成的一类功能性生物聚酯。由于PHA具有生物可降解性、生物相容性、气体阻隔性、压电性、非线性光学活性以及由官能团引起的其他特殊性能，因此它是一种优良的生物可降解塑料，具有广泛的应用前景，受到国际上的普遍关注[1]。目前，由于石化原料的缺乏和环境问题，生物可降解塑料领域已经吸引了越来越多的关注，成为国际上研究的热点。

利用微生物发酵生产聚酯类可降解塑料是目前生产生物可降解塑料的主要途径之一。自然界中许多属、种的细菌在细胞内都能积累 PHA作为能量和碳源的储备，如产碱杆菌、甲基营养菌及鞘细菌等[2-3]。微生物合成的 PHA含量可以达到细胞干重的 70%～80%，因此微生物是生产生物可降解塑料的良好宿主。但是，自然微生物中PHA的合成都是在碳源过量，限制氮、磷等生长条件下产生的。在这种培养条件下，微生物的生长不均衡影响了细胞的代谢和生长，使得最终的产物产率并不高。而大肠杆菌作为一种研究得最为清楚的微生物，具有生长快、培养简单、可以利用木糖等多种碳源、遗传操作体系清楚等特点[4]，非常适合于用作微生物的细胞工厂生产能源和生物基化学品。并且，大肠杆菌不含有聚酯的降解酶，合成的PHB不会被降解；易于破碎，有利于PHA的提取纯化[5]。

但是，野生大肠杆菌在利用混合糖生长的时候会出现碳源代谢阻遏现象 (Carbon catabolite repression，CCR)，在生长曲线上表现为菌体的二次生长[6-7]。本课题组在前期的研究中通过改造编码磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖转移酶系统 (Carbohydrate phosphotransferase system，PTS) 中的葡萄糖转移酶的ptsG基因，消除了CCR的影响，提高了大肠杆菌糖代谢的效率，为大肠杆菌同时利用多种糖的混合物提供了基础[8]。另外，在传统的基因工程菌的发酵培养中都使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG) 作为诱导剂诱导外源蛋白的表达。该方法具有一定的局限性：1) IPTG价格昂贵，生产成本高；2) IPTG对细胞具有一定毒性，会抑制菌体生长；3) 加入诱导剂的时机不好掌握[9-10]。本实验室构建的一种依靠外界环境自发诱导的质粒克服了上述缺点，能够用于工业生产[11]。

因此，在以上分析和研究的基础上，试图建立一种适宜于工业化生产聚酯类生物可降解塑料的微生物菌株和方法，为生物可降解塑料的生产提供基础。本研究以聚羟基丁酸酯 (PHB) 作为前期目标，以工业生产木糖醇的废液浓缩得到的“糖蜜”作为廉价的混合碳源，初步进行了PHB的发酵试验。“糖蜜”是玉米芯水解液在生产木糖醇之后的废液经浓缩后得到的，其总糖含量约为 60%。糖蜜中主要成分为木糖，约占总糖含量的65%以上，其次是葡萄糖，占总糖含量25%左右，另外还有少量的阿拉伯糖等。

1 材料与方法

1.1 菌种与质粒

本研究中用到的菌种和质粒见表1。

表1 菌种与质粒Table 1 Strains and plasmids

1.2 培养基

种子培养基：蛋白胨 10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，加水定容至1 000 mL，调pH为7.0。

发酵培养基：Na2HPO4·12H2O 17.1 g，KH2PO43 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1 g，1 mol/L 的 MgSO42 mL，0.1 mol/L的CaCl21 mL，10 mmol/L的硫胺素 5 mL，加水至1 000 mL，调pH为7.2。

1.3 主要仪器和试剂

生物反应摇瓶柜 (上海欣蕊自动化设备有限公司)，Gene Pulser Xcell 电穿孔系统 (Bio-Rad)，高效液相色谱仪 LC-VP (Shimadzu)，气相色谱仪GC2010 (Shimadzu)，5 L玻璃发酵罐 (上海保兴生物设备工程有限公司)，PCR仪 (Bio-Rad)。DNA工具酶购自 Fermentas公司，实验中用到的引物由Invitrogen公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

1.4 培养方法

种子培养：从平板挑取单菌落至装有50 mL种子培养基的300 mL三角瓶中，置于37℃摇床中，240 r/min培养10 h。

发酵培养：将种子液以 5%接种量接入装有300 mL培养基的1 000 mL三角瓶中，置于37℃摇床，240 r/min培养。

限氧培养：限氧培养实验在生物反应摇瓶柜中进行。在装有500 mL发酵培养基的反应瓶中按5%的接种量接入种子液。通过打开和关闭通入各瓶的空气阀门实现不同阶段的限氧控制。

发酵罐分批培养：分批发酵在5 L发酵罐中进行。用5 mol/L的NaOH溶液控制pH在6.8左右；通过调节搅拌转速维持发酵前 12 h溶氧在 30%以上，从第12 h开始到发酵结束控制溶氧在30%以下。

1.5 基因敲除

本研究采用 Red重组系统敲除大肠杆菌 DH5α中的ptsG基因，具体操作方法参见文献[13]。敲除过程中用到的引物见表2。

表2 引物序列Table 2 Primers designed for gene knockout

1.6 检测方法

1.6.1PHB检测

准确称取15 mg冻干的菌体放入反应瓶中，向其中加入1 mL氯仿、850 μL甲醇和150 μL浓硫酸，密封后沸水浴1 h后，向反应瓶中加入1 mL蒸馏水，剧烈混匀后，静置分层。抽取有机层过滤后用气相色谱仪分析。气相色谱分析方法参见文献[14]。

1.6.2糖浓度检测

菌液室温下12 000 r/min离心2 min，取上清，然后用孔径为0.22 μm的无菌滤膜过滤，用高效液相色谱检测发酵产物。检测器为视差折光检测器RID-10A，色谱柱为HPX-87H (300 mm×7.8 mm)，流动相为5 mmol/L的硫酸溶液，流速为0.6 mL/min。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌生产菌株的选择

各种大肠杆菌的代谢能力和代谢水平不同。例如E. coliW3110适宜于发酵，而E. coliMG1655适宜于好氧生长。为了考察常用的大肠杆菌工程菌适宜于PHB合成的情况，分别对E. coliDH5α/pBHR68、E. coliMG1655/pBHR68和E. coliW3110/pBHR68进行了初步发酵试验 (图1)。E. coliDH5α/pBHR68无论从最终菌体浓度还是胞内PHB含量上，都要优于其他两种菌。因此，本实验选用 DH5α/pBHR68作为PHB生产的出发菌株。

图1 不同大肠杆菌菌株生产PHB的情况比较Fig.1 Production of PHB with differentE. colistrains.

2.2 大肠杆菌利用各种碳源合成PHB的比较

PHB作为生物基产品，其生产原料的价格对其生产成本影响很大。因此，选择了几种常用廉价碳源的单糖，分析大肠杆菌工程菌利用这几种糖生产PHB的能力 (表 3)。从表中可以看出重组大肠杆菌以葡萄糖为碳源时，菌体终浓度最高，可达到4.31 g/L，胞内PHB含量也可达到46%左右；以木糖为碳源时，其菌体终浓度略低于葡萄糖，但其胞内 PHB含量却是最高的，可达到 49%；以乳糖和L-阿拉伯糖为碳源时，菌体浓度和PHB含量相对要低一些。这说明大肠杆菌工程菌可以利用各种碳源合成PHB，特别是木糖在生产PHB方面并不逊于葡萄糖，并且其转化为PHB的转化率为0.19，比葡萄糖要高。因此，木糖是生产 PHB的一种良好碳源。

表3 不同碳源合成PHB结果比较Table 3 Comparison of PHB accumulation inE. colifrom different carbon sources

2.3 多种碳源同时利用的工程化大肠杆菌的构建

从上面的研究结果中可以看出，多种碳源都可以用于PHB的生产，而且许多廉价碳源都是多种糖的混合物，例如半纤维素的水解物就是葡萄糖、木糖等的混合物。因此，研究了重组E. coliDH5α利用糖混合物生产PHB的情况 (图2A)。由图可以看出，E. coliDH5α/pBHR68可以利用多种碳源，但是CCR的存在，导致大肠杆菌在利用混合碳源生长时，会优先利用葡萄糖，等葡萄糖耗尽之后才会利用木糖。这将导致大肠杆菌生长过程出现停滞期，降低糖利用效率，延长发酵周期。为了消除大肠杆菌CCR的影响，利用本实验室建立的方法在E. coliDH5α中敲除了ptsG基因[8]。通过发酵试验，发现E. coliDH5α ΔptsG/pBHR68菌株能够同时利用葡萄糖、木糖，而且生长速度明显变快，PHB也能够快速积累，只需 30 h左右菌体和 PHB的浓度均达到最高 (图2B)。并且，E. coliDH5α ΔptsG/pBHR68 菌株产生的PHB占细胞干重的含量较初始菌株DH5α有较大提高，可以达到60%以上。

图2 大肠杆菌在混合碳源中的生长和PHB的积累Fig.2 Growth and PHB accumulation ofE. coliin sugar mixture. (A)E. coliDH5α/pBHR68. (B)E. coliDH5α ΔptsG/pBHR68.

2.4 工程化大肠杆菌在发酵过程中诱导和培养的优化

利用大肠杆菌工程菌生产PHB存在一定的局限性。为此，本实验室在前期的研究中构建了一种能够通过环境压力变化诱导PHB合成的系统[11]。本实验将该系统用在E. coliDH5α ΔptsG中，并和IPTG诱导系统中PHB积累的能力作了比较 (表4)。在环境诱导系统中PHB产量和菌体生长都得到了大幅的提高，菌体终浓度可达到 6.24 g/L，比含 pBHR68质粒的菌株提高了近20%。推测环境诱导系统导致菌体和PHB产量提高的原因在于该调控系统的启动强度。GFP表达检测结果表明，该系统的启动迅速并且强度大于Lac启动子[11]。同时，该系统的应用可以消除IPTG对菌体生长的抑制作用，也能从一定程度上提高菌体和PHB的产量。

表4 比较重组大肠杆菌在IPTG和环境诱导系统中PHB的积累Table 4 Comparison of PHB production in IPTG induced system with that in stress-induced system

除了诱导，通氧也是影响发酵生产中成本的关键因素。文献报道，限氧有利于大肠杆菌中PHB的合成[15]。因此，在摇瓶柜上初步优化了氧气的条件，为发酵罐发酵培养提供了基础。在 4个平行培养的摇瓶中，分别按4种不同的培养方式供氧：全程供氧、全程限氧、0～24 h限氧和24～48 h限氧。如图3所示，在菌体生长阶段的24～48 h限氧既能保证菌体生长速度，又能提高胞内PHB的含量。这一培养模式符合Wang等的PHB二阶段生产模型[15]。因此，选择该培养方式作为发酵培养控制溶氧的依据。

图3 通氧对重组大肠杆菌PHB合成的影响Fig.3 Effect of oxygen limitation on PHB synthesis in recombinantE. coli.

2.5 实验室中利用廉价底物分批发酵试验

以E. coliDH5α ΔptsG/pQKZ103 作为发酵菌株，以“糖蜜”为原料，在5 L发酵罐中进行了PHB发酵试验。初始总糖浓度约为 30 g/L，发酵过程中通过5 mol/L的NaOH控制pH在6.8左右；从第12 h开始到发酵结束控制溶氧在30%以下。在发酵32 h后，糖基本耗尽，大肠杆菌 DH5α ΔptsG/pQKZ103的菌体终浓度达到 8.24 g/L，PHB占细胞干重的84.6% (图4)。从图上可以看出，发酵的前16 h菌体快速生长，16 h之后PHB得到大量积累，这与第12 h开始限氧基本相符；本批发酵糖代谢较为彻底，糖转化为PHB的转化率约为0.243。图5为培养48 h时的菌体在透射电镜下的照片。从照片上可以看出，大肠杆菌胞内已经被 PHB颗粒充满，并且产生的PHB颗粒较大，有利于PHB的提取。

图 4 重组大肠杆菌分批培养菌体生长、糖消耗及 PHB含量曲线Fig.4 Time profiles of cell concentration, sugars concentration and PHB content of recombinantE. coliin batch culture.

图5 重组大肠杆菌DH5αΔptsG/pQKZ103透射电镜照片Fig.5 Transmission electron microscopy photo of recombinantE. coliDH5α ΔptsG/pQKZ103.

3 结论

由于大肠杆菌拥有许多优势，利用工程化大肠杆菌生产生物可降解塑料一直是人们追求的一个方向。但是，大肠杆菌作为细胞工厂也有一定的缺点，本研究通过对大肠杆菌E. coliDH5α的初步改造使之适宜于多种碳源的利用，并通过非IPTG环境诱导系统的应用，初步解决了大肠杆菌应用于PHB生产过程中的一些问题。实验室发酵结果证明该菌利用玉米芯水解浓缩液作原料能够很好地实现大肠杆菌的快速生长和PHB的高效积累，具有良好的前景。

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Efficient polyhydroxybutyrate production from cheap resources by recombinantEscherichia coli

Guoqing Wei1,2, Quan Chen1, Zhen Kang1, and Qingsheng Qi1

1State Key Laboratory of Microbial Technology,Shandong University,Jinan250100,China
2College ofScience,Jiangxi Agricultural University,Nanchang330045,China

Received:November 17, 2009;Accepted:February 25, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30870022), National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2007CB707803).

Corresponding author:Qingsheng Qi. Tel: +86-531-88365628; Fax: +86-531-88565610; E-mail: qiqingsheng@sdu.edu.cn

国家自然科学基金 (No. 30870022)，国家重点基础研究发展计划 (973计划) (No. 2007CB707803) 资助。