大鼠癫持续状态后miR-21、miR-29的表达变化

张忱,李蜀渝,肖波,胡崇宇,刘人恺

中南大学湘雅医院神经内科,长沙 410008

张忱,李蜀渝#,肖波,胡崇宇,刘人恺

中南大学湘雅医院神经内科,长沙 410008

目的:探讨miR-21、m iR-29在癫持续状态(SE)大鼠脑组织和外周血中表达的变化及意义。方法:SD大鼠30只,随机分为SE组20只和对照组10只,SE组建立氯化锂-匹罗卡品致大鼠SE模型,对照组以生理盐水代替匹罗卡品,应用RT-PCR检测2组大鼠脑组织和外周血miR-21、miR-29的表达。结果:与对照组比较,SE组大鼠海马区脑组织和外周血中m iR-21表达均下降(P＜0.05),miR-29表达均升高(P＜0.05);miR-21在外周血中的表达显著高于脑组织(P＜0.01),m iR-29在外周血中的表达稍低于脑组织(P＜0.05);结论:miR-21、miR-29可能参与SE后神经元凋亡的调控过程,外周血miR-21和m iR-29变化可反映脑组织中的变化趋势。

m iRNA-21;m iRNA-29;癫持续状态;匹罗卡品;凋亡

microRNAs(miRNA s)是一种长度为20～24个核苷酸的内源性非编码蛋白的小RNA基因,在动植物细胞中通过与靶基因特定序列相互作用,在转录后水平负性调控靶基因的表达[1]。近年来,越来越多的 m iRNAs被发现,并被认为参与调控生物的发育、神经分化、细胞增殖、凋亡和脂肪代谢等,是细胞增殖分化和生物体发育过程中重要的调控因子[2]。m iR-21、miR-29作为目前研究较多的miRNAs,被认为与细胞凋亡存在密切联系。癫持续状态(status epilep ticus,SE)可引起细胞凋亡,易致海马神经元损伤,可引起急性和持久性中枢神经系统损害。本研究建立氯化锂-匹罗卡品SE模型,探讨大鼠SE后海马区组织及血液中miR-21、miR-29的表达变化及其意义。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:6～8周龄清洁级健康雄性Sp rague-Daw ley大鼠30只,由湘雅医学院实验动物学部提供,体质量(250±20)g,随机分为SE组20只和对照组10只。②主要试剂与材料:T rizol试剂盒(购于Invitrogen公司),M x3000P实时荧光定量PCR仪(购于美国Stratagene公司),PCR引物由上海吉玛制药技术有限公司设计和合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制备 SE组采用腹腔注射氯化锂-匹罗卡品方法制备模型[3],腹腔注射氯化锂125 mg/kg,18～20 h后腹腔注射匹罗卡品20mg/kg,若无性发作或发作程度未达Racine标准Ⅳ级者,每30 min重复腹腔注射匹罗卡品10 mg/kg,直至最大剂量60mg/kg。达 Racine标准 Ⅳ级超过 30 min以上者为SE模型制备成功。腹腔注射6次后仍未达到 Ⅳ级者弃用。大鼠SE持续50min后腹腔注射10%水合氯醛 3 m L/kg终止发作。对照组用生理盐水代替匹罗卡品腹腔注射。

1.2.3 总 RNA的提取 取每组各5只大鼠海马区脑组织,采用液氮研磨法将组织磨成粉末,血液标本经淋巴细胞裂解液处理;加入T rizol混合,按Trizol试剂盒说明抽提总RNA;并进行凝胶电泳检测RNA质量。

1.2.4 RT-PCR检测 miR-21、m iR-29表达采用m iRNA s定量 RT-PCR检测试剂盒分别检测2组大鼠海马区脑组织及血液中miR-21、miR-29的表达量,反应在 M x3000P实时荧光定量PCR仪上完成,以U 6作为内参基因,引物序列如下:miR-21 F引物:5'-ACGTTGTGTAGCTTATCAGACTG-3 ';miR-21 R引物:5'-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3';miR-29 F引物:5'-CATCTGACTAGCACCATCTGAAAT-3';miR-29 R引物:5'-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3'。

1.3 统计学处理 数据用SPSS 12.0统计软件包进行处理,结果以(x±s)表示,t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察 对照组大鼠无行为学变化,SE组20只大鼠均有面部抽搐,17只达RacineⅣ级,发作时间为给药后15～40 min,平均(24.5±8.7)min。有 3只发作未达RacineⅣ级,另有2只在发作后24 h内死亡。

2.2 RNA提取结果 提取RNA后进行凝胶电泳检测,28 S和18 S电泳条带清晰,见图1。

图1 RNA琼脂糖凝胶电泳结果 1、2泳道为对照组脑组织总RNA,3、4泳道为SE组脑组织总RNA,5、6泳道为对照组外周血总RNA,7、8泳道为SE组外周血总RNA

2.3 海马脑组织miR-21、miR-29表达变化与对照组比较,SE组大鼠海马区脑组织中miR-21表达水平下降(P＜0.05),miR-29表达水平升高(P＜0.05),见表1。

表1 2组海马区脑组织m iR-21、miR-29表达比较(x±s,dRn)

2.4 血液中m iR-21、miR-29表达变化 与对照组比较,SE组大鼠血液中m iR-21表达水平下降(P＜0.05),miR-29表达水平升高(P＜0.01),见表2。

表2 2组血液中 miR-21、miR-29表达比较(x±s,dRn)

2.5 脑组织和血液miRNA的比较 m iR-21在外周血中的表达量显著高于脑组织(P＜0.01),见图2A;miR-29外周血中的表达稍低于脑组织(P＜0.05),见图2B。

图2 A-B 2组脑组织和血液中m iR-21(A)、m iR-29(B)表达比较

3 讨论

miR-21是较早发现的人类miRNA之一,研究发现miR-21在人类多种肿瘤组织中表达上调,起抗凋亡作用。例如SchMittgen等[6]发现,在结肠癌细胞中,miR-21明显高表达;Chan等[7]在神经胶质母细胞瘤患者肿瘤组织中发现miR-21表达增加5～100倍,当miR-21表达被抑制后Caspase-3活性增加3倍,胶质母细胞瘤细胞凋亡增加、细胞数量明显减少,这表明miR-21表达与调节细胞凋亡有密切关系。本研究发现,大鼠SE后,在大鼠海马区脑组织中miR-21的表达量低于对照组(P＜0.05)。以往研究表明,在SE后大鼠海马区Caspase-3活性蛋白在24 h达高峰[8],由此表明miR-21在SE后的细胞凋亡过程中起促进作用。Meng等[9]研究发现,抑制miR-21的表达能够促进化疗药物吉西他滨对胆管癌细胞引发的细胞凋亡,并发现miR-21的第1个靶基因PTEN,揭示了miR-21在活化PI3K通路中的作用,初步提示m iR-21的一条抗凋亡途径。2007年4月Si等[10]研究发现,miR-21的反义核苷酸能够在体内和体外模式中有效抑制乳腺癌细胞MCF-7的生长,而且这种抑制可能和导致抗凋亡因子BCL-2的下调有关。随后有人陆续在关于乳腺癌m iRNA的研究中发现miR-21的 2个靶基因:PDCD4和 TPM 1。PDCD 4和 TPM 1属于凋亡前诱导因子,而miR-21的高表达下调了PDCD4和TPM 1[11]。总之从 miR-21的调控靶基因看,miRNA直接调控PI3K通路的2个下游基因PTEN和PDCD4,这是miR-21促进肿瘤细胞存活的原因之一,miR-21还直接调控凋亡通路中的凋亡促进因子N IFB,并受其负调控。

miR-29是近年发现的主要miRNA之一,是血液系统疾病和内分泌疾病中的研究热点。Garzon等[12]研究发现在急性粒细胞性白血病外周血白细胞中miR-29的表达被抑制,并证明将miR-29转染入白细胞可促进细胞凋亡。另外,Xiong等[13]发现在肝细胞癌组织中miR-29的表达减少,并且与肝细胞癌患者的生存率呈正相关。本研究发现,在SE组大鼠海马区脑组织中m iR-29的表达量明显高于对照组(P＜0.05)。有研究发现miR-29可抑制抗凋亡分子Bcl-2和M cl-1表达,最终促进凋亡。由此表明,SE后海马组织的miR-29表达上调促进细胞凋亡。

本研究首次对动物脑组织中和外周血中的miRNA s的表达量进行对比,发现miR-21和miR-29在外周血中均有表达,而且表达变化的趋势一致,miR-21的表达量远高于脑组织,而miR-29则与脑组织中基本相近。这提示外周血的 miR-21和m iR-29变化可反映其在脑组织中的变化,其意义有待进一步深入研究。

综上所述,本研究发现,在SE后大鼠海马区脑组织与外周血中均存在miR-21、m iR-29表达量的变化,它们均促进细胞凋亡的发生,参与SE后神经元凋亡的调控机制。作为广泛存在的对基因表达进行调节的分子,miRNAs主要是通过抑制它的靶基因而起调控作用。笔者将在后续研究中寻找m iR-21、miR-29调控的靶基因群,对其调控SE后细胞凋亡的信号通路进行深入探讨,以期找到新的防治癫 发生后神经元损伤的方法。

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【编者按】

人类疾病的动物模型是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物。借助动物模型，可以更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律，研究防治措施。在对神经科常见多发病（如脑梗死、脑出血、癫痫及脊髓损伤等）的研究中，动物模型被广泛使用，具有重要意义。从本期开始，本刊将连续刊登关于神经科疾病动物模型的相关文章，以加强对此领域的认识。

Expression of miR-21 and m iR-29 in Rats after Pilocarpine Induced Status Epilepticus

ZH ANG Chen▲,LI Shu-Yu,XIAO Bo,HU Chong-Yu,LIU Ren-K ai.▲Department of Neurology,X iangya Hospita l,Centra lSouth University,Changsha 410008,China

Ob jective:To investigate the expression of m iR-21 and miR-29 in the rat brain tissue and peripheral b lood fo llowing status epilep ticus(SE).M ethods:The lithium-pilocapine model of statusepilepticuswasestablished in SD rats.The expression ofmiR-21 and miR-29were examined using RT-PCR.Results:Compared with the controlgroup,SE group show s decreased exp ression ofmiR-21(P＜0.05)as well as increased the exp ression ofmiR-29(P＜0.05)both in brain tissue and peripheral blood.Them iR-21 in peripheral blood was significantly higher than that in brain tissue(P＜0.01);However,themiR-29 in peripheral blood was slight lower than that in brain tissue(P＜0.05).Conclusion:ThemiR-21 andmiR-29may be involved in the neuronal apoptosis processafter SE.The changesofm iR-21 andm iR-29 in peripheralblood could reflect the pathological changes in brain after SE.

miRNA-21;m iRNA-29;statusepilepticus;pilocarpine;apoptosis

R741;R741.02;R742.1

A

1001-117X(2010)03-0166-04

10.3870/sjsscj.2010.03.003

2010-03-02

#【通讯作者】李蜀渝,Tel:86-731-84327216,E-mail:lishuyu63@sina.com。