闪式柱层析技术的研究进展*

陈胜发,胡莉娟,马文龙

(1.杨凌职业技术学院,陕西杨凌 712100;2.杨凌示范区医院,陕西杨凌 712100)

闪式柱层析(Flash Chromatography,简称闪柱)是国外于20世纪80年代兴起的一种快速层析技术,它的最大特点就是分离相当迅速。完成一个重量为0.01～10 g的混合物样品的分离,从装柱、上样到洗脱分离,整个过程只需要15～60 min。国外的化学实验室已经普遍采用这个分离技术了,国内部分实验室也有此套装置。现就闪柱的性质特点和应用综述如下。

1 装置

闪柱首先由Still等于1978年详细介绍,其目的在于缩短常压柱色谱的操作时间,该技术于1981年获专利保护(美国专利4,293,422)[1]。色谱分离时,进行长时间的洗脱有两个缺点:敏感化合物可能被分解和色带容易拖尾。这两个问题在天然产物分离中经常会遇到,而闪柱的出现很好的解决了这个问题。最初一个典型的闪柱色谱分离装置包括一装有活塞、长度适合的玻璃柱,可用干法或湿法将固定相加入其中。干法装柱效果更好,但需用大量溶剂使固定相完全润湿。在固定相的顶部最好加一层沙子,固定相的上端应留有足够的空间以便反复加人洗脱剂,也可在柱顶装一滴液漏斗作为储液槽。加样后,使柱与气体人口相联,该处装一针式阀门以控制压缩气体的流速。可施加高于大气压1 bar的压力使样品洗脱。利用不同尺寸的色谱柱对0.01～10.0 g样品所进行的分离通常可在15 min内完成。

现在人们已开发的闪柱色谱系统的商品有以下几种。

(1)Biotage径向柱压缩系统 (Charlottesville VA USA):每次可分离1～250 g样品,最大流速可达250 mL/min(压力可达7 bar),该系统有 FLASH 12型、FLASH 25 型、FLASH 40型、FLASH 75型和FLASH 150型五种型号。其中的数字代表柱子的直径,例如 FLASH 75型,表示柱子的直径为75 mm(可装200～800 g,KP-SIL 60A硅胶)。

(2)BAKER公司出售的系列色谱柱。

(3)ALDRICH公司出售的系列色谱柱。

(4)TOKYO RIKAKIKAI公司出售的EYELA快速色谱装置。

2 闪柱在天然产物分离中的应用

闪柱已经被广大科研工作者所热爱,并在天然产物分离中得到广泛应用。下面为闪柱在天然产物分离中应用的一些实例。

2.1 皂 苷

许多柠檬苦素苷类用常规的方法不容易分开,而且柠檬苦素类遇酸容易分解。所以Raman等[2]采取反相C18硅胶闪柱系统,甲醇-水梯度洗脱,分离出一系列结构类似的柠檬苦素苷类:nomilin 17-D-glucopyranoside and nomilinic acid 17-D-glucopyranoside。

2.2 生物碱

Hou等[3]配合使用硅胶和反相C18硅胶闪柱系统,只用两步就得到了纯度很高的oxymatrine(氧化苦参碱)。

2.3 黄 酮

在枳实类药材中,黄酮苷类成分(Naringin,Hesperidin)是其中的主要成分。虽然两者大量存在,但是由于两者结构相近而且极性都比较大,用常规的方法不容易分开。所以Raman等[4]采取反相C18硅胶闪柱系统,甲醇-水梯度洗脱,分离这两个黄酮苷类成分。这是一种快速高效的方法,并不昂贵,而且其纯度都很高。

2.4 苯丙素类

2006年xiao等[5]利用正相硅胶闪柱系统和制备型HPLC从Green Onion(Alliumspp)的脂溶性部分分离出Ⅱ相代谢酶的诱导剂(p-Hydroxyphenethyl trans-Ferulate)。

2.5 萜类

1989年Alam等[6]使用采取正相硅胶闪柱系统从Ascochyta rabzei菌的培养液中分离得到2种毒素,证实了这种菌就是导致植物发生枯萎病的元凶。向柱中填入60A的硅胶(230-400 mesh),以正己烷-乙酸乙酯系统(3∶1-1∶1其中含有0.1%乙酸)进行梯度洗脱。收集了30个流份,得到2种毒素:solanapyrones A和solanapyrones C。

1999年Millar等[7]采用精馏,化学法和闪式柱层析的方法,简单快速分离出1种倍半萜zingiberene,纯度超过99%。向FLASH柱中填入40～63 μm Silica gel(Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI),采用正己烷-丙酮 (15∶85)系统等度洗脱得到倍半萜和PTAD的加成产物。最后经过 LiAlH 4还原,得到高纯度的zingiberene。

2000年Takeoka等[8]利用正相硅胶闪柱系统从苦杏仁的外种皮中分离出3个三萜类化合物,白桦酸(betulinic acid),齐墩果酸(oleanolic acid)和熊果酸(ursolic acid)。采用CH2N2进行甲基化,产物进行正相硅胶闪柱层析,填充Merck grade 9385(230～400 mesh),采用戊烷-乙醚系统梯度洗脱,分成6个流分,再用制备型HPLC纯化得到三萜化合物。

2001年Jiang等[9]利用反相硅胶闪柱系统从日本胡椒的嫩叶中发现了新的单萜苷类化合物(3S,6S)-cis-linalool-3,7-oxideβ-D-glucopyranoside 和 2-methylpropanyl 6-O-β-D-apiofuranosylβ-D-glucopyranoside。

2001年Sabine等[10]利用反相硅胶闪柱系统成功地从从亚洲蓍(Achillea asiatica)中分离出了大极性的愈创木內酯类化合物。采用正相闪柱系统[ICN Silica TSC,60A(53 cm×20 cm)],二氯甲烷-丙酮梯度系统洗脱,流速为 20 ml/min,得到一系列大极性的愈创木內酯类化合物。例如:8-desacetyl-matricarin.

2004年Shibata等[11]利用正相硅胶闪柱系统快捷地分离出高纯度的胡萝卜醇(Lutein)。湿法上样,采用正相 FLASH(30 mm i.d.×260 mm)柱,压力为1～2 kg/cm2进行洗脱,先用正己烷洗脱,得到胡萝卜素的混合物,再用正己烷-丙酮-氯仿洗脱得到胡萝卜醇(Lutein)。

2.6 海洋天然产物

1987年Blunt等[12]总结了一套行之有效的方法,利用反相C18硅胶闪柱系统对海绵等(含大极性的化合物)海洋天然产物进行初步的分段处理。粗样溶解于CH2Cl2-MeOH-H2O(250 ml),使用5 g反相材料进行拌样,装入柱顶,以水平衡柱子。以表1的方式进行洗脱,同时测定每个流份的细胞毒活性。

表1 不同洗脱液对应的流份的质量及其细胞毒活性

1996年 Edwards等[13]利用 BiotageFlash 75 s闪柱系统从蓝绿藻原柱生物中分离得到微囊藻素(microcystins)。他们在9 cm×7.5 cm的色谱柱中装Hperprep C18(30μm,120 A)或不规则状的μ-Bordapak C18(37-55μm,125 A)固定相,将提取的水液过滤后以100 ml/min加入,然后以10%梯度增加的甲醇-水系统 (0%～100%)进行洗脱,最后用制备型HPLC纯化得到微囊藻素(microcystins)。

1999年Law tona等[14]反复利用Biotage闪柱系统对疏水性的微囊藻素进行了制备性纯化。首先他们利用Flash 12(其中预装好flash KP-Sil silica)来摸条件,选好条件后,在放大使用Flash 40进行制备,采用梯度洗脱,得到微囊藻素纯度达到90%。最后采用反相硅胶闪柱系统进行纯化,利用反相Flash40(其中预装好flash KP-C18 silica),先用水进行洗脱,除去其中混有的醋酸,再用甲醇洗脱下微囊藻素,其纯度达到95%。

1999年Kevin等[15]使用采取正相硅胶闪柱系统结合制备液相技术,快速高效地从海洋浮游植物中分离到一种罕见的毒素:dinophysistoxin-2(DTX-2)。

2001年Van Wagoner等[16]利用反相C18硅胶闪柱系统和氰基柱制备液相分离得到一个新的蝶啶类化合物:1,3,O7-trimethylisoxanthopterin。采用反相C18硅胶闪柱系统,甲醇-水梯度洗脱,样品采用湿法上样,在其中加入 0.1%TFA助溶,再利用氰基柱制备液相纯化得到 1,3,O7-trimethylisoxanthopterin。

2.7 其他天然产物

2004年Taylor等[17]采用闪柱系统,离子交换柱从豌豆提取物中分离到肽类的混合物。商品化的野豌豆粉末去酯后,其甲醇提取物用正相硅胶柱以二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱得各部分,其中Fr8显示有杀虫活性。Fr8(150 mg)用内部预置有8 g硅胶的FLASH12装置(Biotage Inc.),以氯仿:甲醇:水 (65∶35∶10)等梯度洗脱,流速为2 ml/min,得到7个亚流分,再用离子交换柱,最后富集得到肽类混合物。

3 展望

闪式柱层析作为先进的层析手段,目前在多种化合物的分离中显示出了很好的分离效果,尤其是闪柱在天然产物分离中逐渐被广泛应用,对于萜类物质的分离纯化有很好的推广前景。闪式柱层析技术逐渐开始与其他色谱技术相结合,并在实践中不断改进,目前国内外正在开发的高通量制备色谱系统和多维色谱系统,这些技术无疑将会使闪式柱层析技术得到丰富和发展,使其在天然产物的分离纯化的研究工作中发挥重大作用,尤其是我国科研人员可以使用此项技术推动我国传统中医药的发展,相信会在传统中医药的现代化中发挥更大的作用。

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