环介导恒温扩增技术快速检测非洲猪瘟病毒*

王彩霞,刘 建,林祥梅,吴绍强

(中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所,北京 100029)

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒科的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]。1921年Montgomery在非洲肯尼亚首先发现。由于对养猪业危害较大,而且尚无有效的疫苗用于防控,因此它被世界动物卫生组织(OIE)列为必报传染病之一。

我国地域辽阔,北部与东欧国家接壤,而东欧国家最近发生的非洲猪瘟疫情必须引起我们的关注。从2007年11月以来的1年时间里,俄罗斯共计暴发非洲猪瘟 45起,感染发病2 586头,死亡2 481头,共计10 583万头猪被淘汰[2]。我国与俄罗斯接壤边境线长达4 300 km,而且很多地区还是陆地接壤,野猪等野生动物跨境活动频繁,建立现场快速检测方法,对于防止疫病跨境传播极为必要。

环介导恒温扩增 (loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是日本学者开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法,具有快速、敏感、特异、仪器设备要求低、结果判定简单等特点。近年来,国内外已应用该法在细菌性疾病[3]、病毒性疾病[4]、寄生虫病[5]等多种动物疫病的检测方面以及植物物种鉴别、转基因与耐药基因研究和胚胎性别鉴定等方面开展了大量的研究工作。

本研究以人工合成的ASFV P72基因为模板,通过设计外引物和内引物,建立了快速检测ASFV的LAMP检测方法,并对结果判定方法进行了敏感性比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 阳性样品 根据GenBank中收录的AY578689核酸序列,由宝生物工程(大连)有限公司合成ASFV P72全长基因并插入载体PMD18-T中,置-20℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 Bst DNA Polymerase购自纽英伦(NEB)生物技术(北京)有限公司,Betaine Hydrochloride购自Biocity公司,SYBR Green nucleic acid gel stain购自Invitrogen公司,Eva GreenTM购自美莱博医学科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 以AY578689为靶序列,利用在线软件Primer Explorer 4设计LAMP扩增的内引物和外引物,设计引物经采用Oligo 4软件进一步筛选后,选择最佳的 1套,送上海英骏(Invitrogen)生物技术有限公司进行合成。引物序列为:ASFF31(5′-GTAGACGCAATATACGCTTTA );ASFB31(5′-GCCATTTAAGAGCAGACATT);ASFFIP1(5′-GACCAAGTGCTTATATCCAGTCATTTTTT GGATCC ATATAGTTCGGATGT);ASFBIP1(5′-GGAGGTATCGGTGGAGGGAATTTT GAATTCGCAAATCATGAATGT)。

1.2.2 非洲猪瘟病毒LAMP检测方法的建立与优化 以P72阳性质粒为模板,分别对反应体系中MgSO4(2mmol/L ～ 32mmol/L)、Betaine(64 mmol/L～1280 mmol/L)、dNTP以及内外引物等各个成分采用不同浓度配制反应体系,将反应管置于实时荧光PCR仪(IQ5,Bio-Rad)上,采用65℃进行反应,每30 s采集一次FAM通道荧光信号,根据最大△Rn值和最小Ct值确定体系中各个成分的最佳用量,并确定最终的反应体系。

1.2.3 LAMP反应温度的优化 采用优化确定的反应体系,将反应温度从60℃～65℃依次递增,共6个反应管,从多次重复试验中确定最佳反应温度。1.2.4 LAMP的敏感性确定 根据优化的反应体系建立LAMP检测方法,取10倍倍比稀释为101拷贝/μ L～107拷贝/μ L 的质粒 DNA 做模板,通过实时荧光PCR仪检测确定所建立LAMP方法的灵敏度,同时设置空白对照。LAMP反应结束后,离心,通过观察白色沉淀的有无来判定结果;继而将每个反应管加入1 μ L预先用DMSO 10倍稀释的SYBR Green进行显色,以颜色变化作为判定结果的标准(绿色为阳性,橙色为阴性);每个反应管取5 μ L用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 LAMP ASFV的特异性检测 采用上述建立的ASFV LAMP检测方法,以中国检验检疫科学研究院动植检所动检实验室保存的虹彩病毒(RGV)、痘病毒等病毒 DNA以及猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等cDNA材料作为对照样品,试验同时设正常猪肌肉组织DNA作为阴性对照,检测所建立方法的特异性。

1.2.6 LAMP扩增产物的酶切鉴定 为了利于LAMP扩增产物的鉴定,本研究设计在内引物ASFFIP1的 F1位置的3′端引入 Bam HⅠ-GGATCC,同时在内引物ASFBIP1的 B1位置的 3′端引入EcoRⅠ—GAATTC酶切位点,于反应结束后,分别采用BamHⅠ、EcoRⅠ对 LAMP产物进行酶切鉴定。试验应用20 μ L酶切体系,置于37 ℃酶切作用1.5 h,然后分别取5 μ L,于15 g/L琼脂糖凝胶电泳后紫外观察。

2 结果

2.1 LAMP反应体系和反应条件的优化结果

根据反应体系和反应条件的优化结果,确定的最佳反应体系(25 μ L)如下:10×Thermopol buffer(2.5 μ L)、100 mmol/L MgSO4(1 μ L)、2.5 mmol/L dNTP(8 μ L)、3.2 mol/L Betaine(5 μ L)、5 μ mol/L ASFF31(0.5 μ L)、5 μ mol/L ASFB31(0.5 μ L)、20 μ mol/L ASFFIP1(1.2 μ L)、20 μ mol/L ASFBIP1(1.2 μ L)、8 U/μ L Bst DNA Polymerase(1.5 μ L)、Eva green(1 μ L)、待 检 样品(1 μ L)、ddH2O补至25 μ L。将反应管置于实时荧光定量PCR仪中65℃反应50 min,每30 s采集一次FAM通道荧光信号。

2.2 荧光PCR判定LAMP检测方法的敏感性

从图1和表1可以看出,随着反应体系中模板DNA含量的减少,反应曲线Ct值逐渐增加。经过多次试验得出所建立的ASFV LAMP方法采用荧光PCR判定结果时的最低检测限为101拷贝(图1中曲线7)。

2.3 观察沉淀方法判定LAMP检测方法的敏感性

LAMP反应结束后,将反应管离心,可在阳性反应管底部看到明显的白色沉淀,而阴性对照则看不到(图2),据此判定采用沉淀观察法判定LAMP检测方法的敏感性为10拷贝(图2中管7)。

2.4 凝胶电泳检测判定LAMP检测方法的敏感性

LAMP反应产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳后,将凝胶置于凝胶成像仪下观察,可见管1～6均有一系列大小不一的条带,而管7和空白对照(管8)都没有(图3),即采用凝胶电泳方法判定ASFV LAMP检测方法的敏感性为100拷贝。

2.5 根据颜色变化判定LAMP检测方法的敏感性

LAMP反应结束后,向每个反应管中加入1 μ L 10倍稀释的10 000×SYBR Green后混匀,可见管1～7均呈现绿色,而空白对照(管8)仍为橙色(图4)。

图1 非洲猪瘟病毒 LAMP检测方法的敏感性试验结果(单位:拷贝/μ L)Fig.1 T he sensitivity result of ASFV LAMP

表1 不同稀释倍数非洲猪瘟病毒质粒DNA与对应Ct值Table 1 Different diluted ASFV plasmid DNA and corresponding Ct value

图2 非洲猪瘟病毒LAMP检测结果的判-沉淀观察结果(箭头处为离心后沉淀部位)Fig.2 T he detection of ASFV with LAMP-observation of precipitation(the arrow shows pellet after centrifugation

图3 非洲猪瘟病毒LAM P检测结果的判定-凝胶电泳检测Fig.3 The detection of ASFV with LAMP-gel electrophoresis detection

图4 非洲猪瘟病毒LAM P检测结果的判定-颜色变化Fig.4 The detection of ASFV with LAMP-color reactivity

2.6 LAMP的特异性检测

试验表明,建立的ASFV LAMP检测方法具有良好的特异性,与RGV、痘病毒以及CSFV、PRRSV无交叉反应,也不受正常猪组织DNA的干扰。

2.7 LAMP扩增产物的酶切鉴定

将ASFV LAMP扩增产物分别用BamHⅠ、EcoRⅠ进行酶切,电泳结果表明,酶切产物均为单一大小的条带,约150 bp大小,与LAMP扩增设计的F2和B2间长度(155 bp)相当(图5)。

图5 非洲猪瘟病毒LAM P扩增产物的酶切鉴定Fig.5 Identification of ASFV with LAMP by enzyme digestion

3 讨论

传统的聚合酶链反应(PCR)是目前检测非洲猪瘟病毒的基因诊断技术中最常用的方法之一,但在特异性、简便程度、试剂仪器要求等方面存在不足[6]。新发展的环介导恒温核酸扩增技术解决了目前基因检测方法的弊端。该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程[7]。在LAMP反应过程中,从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,其反应产物焦磷酸镁乳白色沉淀即可通过肉眼观察判定结果[8],或加入荧光染料,通过颜色变化来判定结果。LAMP反应是在恒温(60℃～65℃)条件下进行的,这种比较温和的温度条件以及没有温度循环从而使得仪器简单化,反应时间缩短。同时,由于LAMP扩增的4条引物涉及到靶序列的6个区段,原理上LAMP法扩增的特异性高于PCR扩增方法;同时,由于反应条件单一,省却了变性过程,扩增效率也得到提升,理论上的检测敏感性为PCR方法的10倍～100倍[9-10]。本研究建立的ASFV LAMP检测方法的灵敏性为10拷贝质粒DNA。

从方法的敏感性比较结果可以看出,电泳观察法敏感性较低,染色法虽然比较直观但容易受引物二聚体非特异性着色的影响,利用荧光PCR可以实时监测反应的整个过程,且灵敏度高,但是PCR仪的缺点就是不适于携带、外出现场检测。江彦增等[9]根据LAMP恒温扩增的特点,采用恒温水浴锅建立了ASFV的LAMP检测方法,半个小时即可观察结果,该研究虽然解决了反应简便、快速的难题,但是此方法不能实时监测结果,且结果的判定采用凝胶电泳检测,需经过繁琐的制胶、电泳以及凝胶成像系统观察,如野外没有凝胶成像系统同样很难完成现场检测。

目前专门用于LAMP检测方法的浊度仪已经上市,采用LAMP浊度仪进行反应可以直接实时监测反应过程中的沉淀,效果更加明显。该仪器便于携带、外出现场检测,如果将来可以解决DNA的现场快速提取,配合LAMP检测的专用试剂,则可实现非洲猪瘟病毒的野外采用、现场结果判定,从而提高动物检疫工作的速度及准确性。

由于LAMP扩增产物为环连接的长链DNA,不同的扩增片段难以通过电泳图谱判定大小作出鉴定。本研究中,通过在扩增引物中引入酶切位点,在扩增反应结束后通过采用限制性内切酶消化的方法,较好的实现了扩增产物的特异性长度检测。

本研究建立的LAMP检测方法为ASFV的检测提供了新的思路,有望成为简易的常规检测方法,尤其适用于基层兽医诊断及检验检疫机构使用。

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