盐酸法舒地尔抑制小鼠EAE作用及机制研究

段惠洁，郭敏芳，尉杰忠，梁丽云，马存根*

(1.山西医科大学第一临床医学院神经内科，山西太原 030001；2.山西大同大学脑科学研究所，山西大同 037009)

盐酸法舒地尔抑制小鼠EAE作用及机制研究

段惠洁1，2，郭敏芳2，尉杰忠2，梁丽云2，马存根1，2*

(1.山西医科大学第一临床医学院神经内科，山西太原 030001；2.山西大同大学脑科学研究所，山西大同 037009)

目的探讨盐酸法舒地尔（Fasudil hydrochloride）对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的抑制作用和可能的机制.方法按平均体重将C57BL／6雌性小鼠分为EAE组、盐酸法舒地尔治疗组和佐剂组，用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35－55多肽（MOG35－55）诱导EAE模型，佐剂组以等量生理盐水代替.治疗组于免疫后6 d开始按50 mg／（kg·d）腹腔注射盐酸法舒地尔，EAE组和佐剂组用等量的生理盐水作为对照.比较各组小鼠的各种表现，并进行症状评分.免疫后18～20 d取各组小鼠，制备脾脏淋巴细胞悬液，用MTT法检测淋巴细胞的增殖情况，用ELISA法检测并比较各组淋巴细胞培养上清液中细胞因子INF－γ、IL－17、IL－10的水平.结果盐酸法舒地尔能够显著改善EAE的症状，减轻中枢神经系统（CNS）炎性浸润及髓鞘脱失等病理变化，并且可抑制脾脏淋巴细胞分泌INF－γ、IL－17（P＜0.05），促进IL－10的分泌（P＜0.05）.结论盐酸法舒地尔可以有效抑制小鼠EAE，这种抑制可能与其对脾淋巴细胞中INF－γ、IL－17表达的下调和IL－10表达的上调作用有关.

盐酸法舒地尔 实验性自身免疫性脑脊髓炎 INF－γ IL－17 IL－10

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种常见的以中枢神经系统（CNS）炎性脱髓鞘病变为特征的自身免疫性疾病.MS的病因和发病机制很复杂，与遗传、免疫、病毒感染等均有关联，但其确切机制尚未完全清晰.探讨MS的免疫学机制一直是人们关注的焦点.MS具有免疫学基础的更多证据来自于动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的研究.EAE是由特异性致敏的CD4＋T细胞介导的发生于敏感实验动物的自身免疫性疾病，而细胞因子的生成和调节是CD4＋T细胞发挥效应作用的主要机制.CD4＋T细胞通常按照其分泌的细胞因子的不同，分为Th1和Th2两种亚型.Th1型细胞产生IFN－γ等细胞因子，介导与炎症有关的免疫应答，具有促炎性作用；Th2细胞分泌IL－10等细胞因子，对EAE和MS的病情有抑制作用[1]；IFN－γ可诱导Th1分化，抑制Th2细胞增殖[2].总之，在EAE和MS的病情演化中，由细胞因子构成的免疫调节网络对其发生、发展以及缓解起着复杂的调节作用[3].

研究表明Rho激酶－II（ROCK－Ⅱ）特异抑制剂——盐酸法舒地尔（Fasudil hydrochloride）通过减少外周淋巴细胞活化和迁移进入CNS，消除CNS的炎症反应；促进神经元胞体以及神经轴突的再生等作用，可以缓解和改善EAE和MS的症状[4].本实验应用Fasudil hydrochloride干预MOG35－55诱导的小鼠EAE，检测脾脏淋巴细胞的增殖以及分泌细胞因子的情况，探讨Fasudil hydrochloride有效改善EAE的可能机制.

1 材料与方法

1.1 材料

健康清洁级C57BL／6雌性小鼠60只，年龄6～8周，体质量 18～22 g，购自北京维通利华公司；MOG35－55由西安联美生物科技有限公司合成，纯度HPLC 97%；百日咳毒素（PTX）购自北京毕特博生物技术有限公司；完全弗氏佐剂（CFA）购自Sigma公司；盐酸法舒地尔注射液为天津红日药业股份有限公司馈赠.

1.2 方法

1.2.1 动物分组及EAE模型制备

清洁级C57BL／6雌性小鼠经适应性喂养1周后，按平均体质量分为3组，即EAE组（20只），法舒地尔治疗组（20只）和佐剂组（20只）.用生理盐水将MOG33－35稀释成终浓度为3 mg／mL，用完全弗氏佐剂（CFA）将结核杆菌（TB）稀释成终浓度为3.5 mg／mL，然后将二者等体积混合，用注射器打成油包水状，制成诱导EAE的抗原乳剂，按每只0.1 mL剂量，对EAE组和治疗组小鼠给予免疫.方法是于小鼠背部后区中线两侧选取4个进针点皮下注射，佐剂组以生理盐水代替MOG33－35稀释液制成乳剂同法注射.记免疫后（p.i.）当日为d0p.i.，各组小鼠于d0p.i和d2p.i.分别给予腹腔注射百日咳毒素（PTX）700 ng／只，作为免疫增强剂.治疗组于d6p.i.开始给予腹腔注射Fasudil hydrochloride 50 mg／（kg·d），每日一次，连续治疗14 d，EAE组和佐剂组给予同等剂量生理盐水.

1.2.2 临床症状评分和体重变化

小鼠经MOG免疫后，隔日采用盲法由两名观察者称量并记录每只小鼠的体重，采用国际通用的5分评分制对小鼠进行临床评分，直至MOG免疫后40 d.评分标准：0分，无任何临床症状；1分，尾部张力消失，可见轻度步态笨拙；2分，一侧后下肢无力，被动翻身后可以恢复；3分，双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可以挪动；4分，双侧后肢瘫痪伴前肢瘫痪；5分，濒死状态或死亡.症状介于两者标准之间者以±0.5计.

1.2.3 取材

于d18～20p.i.用3%戊巴比妥麻醉动物，无菌取出脾脏后，生理盐水心脏灌流，4%多聚甲醛灌流固定，解剖分离脑和脊髓，石蜡包埋做病理切片，行HE染色和Luxol Fast Blue髓鞘染色.

1.2.4 脾淋巴细胞的分离与制备

于d18～20 p.i.各组取8只小鼠，麻醉后75%酒精皮肤消毒，无菌取出脾脏，剪碎，用注射器针芯研磨，400目尼龙滤网过滤，置于 15 mL离心管，加入已消毒预冷的PBS中，1 200 r／min离心5 min，弃上清，再加入PBS，反复吹打重悬后再次离心，PBS洗3次，弃上清，按2 mL／管加入已消毒预冷的双蒸水，低渗裂解红细胞，45 s后按 1 mL／管快速加入已消毒预冷的2.7 mg／100 mL的NaCl，使还原为等渗，用已消毒预冷的 PBS补充体积至10 mL左右，1 200 r／min离心5 min，弃上清，重悬，细胞计数，用DMEM完全培养液（高糖DMEM，5%的胎牛血清，100 U／mL青霉素－链霉素）将各管细胞密度调整至 1×109／L，接种在 96孔板中，200 μL／孔细胞悬液，置于 37℃、5% CO2培养箱中孵育.

1.2.5 MTT法测定脾淋巴细胞增殖

脾淋巴细胞培养48 h后，收集上清液，－20℃冻存.之后每孔加入MTT（5 g／L）35 μL，每组设8个复孔.37℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h，小心吸干液体，每孔加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），震荡10～15 min使紫色结晶充分溶解，用酶标仪测定A490值.

1.2.6 脾淋巴细胞上清液中细胞因子的检测

96孔板中分别加入50 μL的捕获抗体，4℃过夜；次日用洗涤缓冲液洗4次后分别加入70 μL封闭液，室温封闭1 h；洗涤液洗涤4次，加入待测上清液，每板设2个空白对照孔，各加入50 μL DMEM不完全培养液，室温2 h；洗涤缓冲液洗4次，加入相应的检测抗体，室温下孵育1 h；洗涤缓冲液洗涤3次，加入50 μL辣根过氧化物酶标记的卵白素，室温下孵育45 min；用洗涤液清洗5次后，加入酶作用底物，室温孵育15～20 min底物显色后，加入50 μL终止液，测定A450值.

1.2.7 统计学处理

2 结果

2.1 发病情况

EAE组小鼠从d11p.i.开始陆续发病，逐渐出现饮食量及活动量减少、反应迟钝等，发病当日体重明显下降，临床表现先是出现尾部肌张力低下，继而进展为双侧后肢无力甚至瘫痪，不能主动翻身，d18p.i.左右症状达高峰，平均临床症状评分（2.571±0.690），发病率达85%.与EAE组相比，治疗组小鼠起病晚，高峰期延迟，症状较轻，发病率低，体重减轻程度明显改善.见表1.

2.2 病理改变：

HE染色显示EAE组小鼠脊髓炎性浸润主要分布在脊髓前角白质、灰白质交界区及正中裂血管周围，浸润细胞以淋巴细胞和中性粒细胞为主，尤以腰膨大炎性浸润比较明显，而Fasudil hydrochloride治疗组炎性浸润明显减轻（图1）.EAE组髓鞘染色可见髓鞘稀疏，不连续，而治疗组髓鞘脱失表现有明显改善（图2）.佐剂组小鼠脊髓未见明显异常改变.

表1 各组小鼠发病情况

2.3 脾淋巴细胞的增殖情况

d18～20检测各组脾淋巴细胞的增殖情况.与对照组相比，EAE组脾脏淋巴细胞增殖作用明显（P＜0.01）；Fasudil hydrochloride治疗组淋巴细胞增殖反应明显受抑制（P＜0.01，表2）.

2.4 脾淋巴细胞上清液中细胞因子的检测结果

对各组脾淋巴细胞分泌的细胞因子INF－γ、IL－17、IL－10进行检测，发现EAE组三种细胞因子的分泌均有增加，盐酸法舒地尔明显抑制IFN－γ、IL－17的分泌，并且促进IL－10的分泌（图3）.

图1 HE染色情况（脊髓HE染色：A、B、C图×10，D、E、F图×40）

图2 髓鞘染色情况（脊髓髓鞘染色：1、2、3图×10，4、5、6图×40）

表2 MTT法测定脾淋巴细胞增殖结果

图3 各组脾脏淋巴细胞上清液中INF－γ、IL－17、IL－10水平

3 讨论

EAE在整个发生发展过程中存在着Th1／Th2细胞偏移，并以激活的Th1细胞占优势的现象.Th1／Th2细胞分泌的细胞因子网络在效应T细胞增殖、分化和作用过程中起着关键作用[5].Th1细胞主要分泌IFN－γ、TNF－α等细胞因子，促进细胞介导的免疫应答，引发和加重EAE；Th2细胞则主要分泌IL－00、HD－4等细胞因子；对EAE有抑制作用[6].IL－1是由IL－23（p40p19）诱导生成的Th17细胞分泌，在MS／EAE中，IL－23／Th17轴起着更为重要的角色.Kebir等[7]发现MS病人血脑屏障（bloodbrain）n－barrier，BBB）细胞表达IL－17和IL－23受体并且体内外IL－17和IL－23均可以诱导BBB内皮细胞表达ACL2，CCL2与Th17细胞表面相应的趋化因子CCR2受体结合后，破坏紧密连接，有效地通过BBB进入CNS，引起CNS炎性改变.

Rho／Rho激酶（Rock）信号途径是机体各组织中普遍存在的一条信号转导通路，其参与调控多种细胞的增殖、分化、运动、移行以及生成和死亡等.Rho／Rock信号途径伴随多种炎症介质和细胞因子受体后耦联机制的活化而激活，通过激酶级联反应直接参与细胞内微丝骨架构型的调控，通过改变细胞骨架构型而介导多种刺激，是细胞行为改变最直接的信号通路.Rho激酶能被多种细胞因子（cytokine，CK）活化，有研究表明，经Rock－Ⅱ特异抑制剂——法舒地尔治疗EAE后，IL－17和Th1类CK，如IFN－γ等明显减少，而Th2类CK，如IL－4，IL－5有轻微的增加，导致IFN－γ／IL－4率明显降低，这些结果和其他Rock抑制剂如Y－27632的结果一致.本研究显示，在EAE发病高峰期培养脾淋巴细胞，检测三组上清液中INF－γ、IL－17、IL－10的分泌，发现法舒地尔治疗组与EAE组相比INF－γ的分泌显著下调，IL－17分泌也有下调但不如 INF－γ明显，IL－10的分泌显著上调，推测Rock－Ⅱ特异抑制剂法舒地尔参与EAE发病高峰期Th1／Th2细胞向Th2的偏移.

本实验中应用Rock－Ⅱ特异抑制剂——Fasudil hydrochloride（d6p.i.给予腹腔注射，连续给药14 d）可以显著降低由MOG35－55诱导的EAE小鼠的发病率，改善临床症状，减轻炎性浸润及髓鞘脱失等病理变化，推测可能是与Rock－Ⅱ特异抑制剂对外周脾脏淋巴细胞增殖的直接抑制和T淋巴细胞的转化有关.Sun等[8]的研究也发现，直接应用Fasudil对EAE有很好的治疗效果，不仅使外周特异性淋巴细胞减少，而且下调了IL－17和 IFN－γ／IL－4的比率.Rho／Rock信号途径与MS和EAE的发病机制密切相关，但是现有的资料仍不能清晰地证明其分子基础和细胞靶点.这些问题的阐明将对探讨EAE和MS的发病机制和寻找新的治疗方法具有特别重要的意义.

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[4]Lingor P,Teusch N,Schwarz K,et al.Inhibition of Rho kinase(ROCK)increases neurite outgrowth on chondroitin sulphate proteoglycan in vitro and axonal regeneration in the adult optic nerve in vivo[J].J Neurochem，2007,103(1):181-189.

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[8]Sun X,Minohara M,Kikuchi H,et al.The selective Rho-kinase inhibitor Fasudil is protective and therapeutic in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Neuroimmunol，2006,180(1-2):126-134.

Abstract：ObjectiveTo investigate the suppressive effect and the possible mechanism of Fasudil hydrochloride on Experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）mice.MethodsAll female C57BL／6 mice were divided by average body weight into EAE group，Fasudil hydrochloride treated group and Adjuvant group.Mice in EAE and treated groups were immunized subcutaneously with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide（MOG35－55）.At the same time，adjuvant group was injected with normal saline instead of MOG35－55.Fasudil hydrochloride was intraperitoneally injected in the dosage of 50 mg（kg·d）in treated group on day 6 post－immunization（p.i），and mice in EAE and adjuvant group injected with normal saline as control.Manifestations of each groups were observed and compared.On day 18p.i，splenic lymphocytes were isolated under asepsis in each group respectively，and splenic lymphocyte suspensions were prepared.The proliferation assay was determined by MTT，and the supernatants were harvested for the detection of INF－γ，IL－17 and IL－10 by ELISA.ResultsFasudil hydrochloride may significant ameliorate symptoms of EAE mice，lessen inflammatory cell infiltration and demyelination，suppress the secretion of INF－γ，IL－17（P＜0.05）and promote the secretion of IL－10（P＜0.05）.ConclusionsFasudil hydrochloride can actively suppress EAE，which perhaps relates to downregulation of INF－γ，IL－17 and up－regulation of IL－10.

Key words：Fasudil hydrochloride；experimental autoimmune encephalomyelitis；interferon－γ；interleukin－17；interleukin－10

〔编辑 杨德兵〕

Effect and Mechanism of Fasudil Hydrochloride on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mice

DUAN Hui－jie1，2，GUO Min－fang1，YU Jie－zhong1，LIANG Li－yun1，MA Cun－gen1，2
（1.Institute of Brain Science，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009；2.Department of Neurology，the First Clinical Medical College，Shanxi Medical University，Taiyuan Shanxi，030001）

R744.5＋.1

A

1674-0874(2010)04-0053-05

2010－03－20

人事部2006年度回国人员科技活动择优资助项目［国人厅发（2006）164号］；山西省自然科学基金［2008011082－1］；山西省回国留学人员科研基金［2007－50］；山西省基础研究计划项目（青年）［2009021041－2］

段惠洁（1981－），女，山西省新绛县人，在读硕士，研究方向：神经免疫学；*马存根，博士，教授，通信作者.