一组用于日本血吸虫病诊断的多肽组合物的初步研究

刘 宇

(湖南理工学院 化学化工学院, 湖南 岳阳 414006)

一组用于日本血吸虫病诊断的多肽组合物的初步研究

刘 宇

(湖南理工学院 化学化工学院, 湖南 岳阳 414006)

为了建立一种快速简便可用于日本血吸虫病抗体检测的磁珠多肽组合物-ELISA免疫诊断方法, 利用蛋白质组学和生物信息学方法筛选日本血吸虫卵可溶性抗原和成虫抗原肽, 制备磁珠多肽组合物结合ELISA进行血吸虫病诊断. 实验表明, 用磁珠多肽组合物-ELISA法诊断急性血吸虫病26例, 慢性血吸虫病32例, 敏感性分别为96.15%和93.75%; 检测肝吸虫病12例, 肺吸虫病15例, 均为阴性. 该方法具有较高的特异性和敏感性, 是一种具有开发前景的血吸虫诊断方法.

磁珠多肽组合物; 血吸虫病; 免疫诊断

日本血吸虫病是我国重点防控的寄生虫病之一. 在血吸虫病的防治中, 准确、及时、快速的诊断是进行有效防治的关键[1]. 病原学的诊断是血吸虫病诊断的确诊依据. 但病原学诊断费时费力, 在群众中依从性差[2], 故在现实的诊断中, 一般将免疫诊断作为辅助诊断手段. 而目前免疫诊断主要采用血吸虫虫卵可溶性抗原作为检测抗原[3]. 但虫卵可溶性抗原的制备具有不均一性以及和其它寄生虫并交叉反应等问题.本研究从血吸虫虫卵和成虫可溶性抗原出发, 运用生物质谱技术鉴定虫卵可溶性抗原, 并对鉴定抗原进行生物信息学分析, 筛选日本血吸虫特有抗原序列进行多肽合成, 运用合成多肽作为检测抗原进行血吸虫病诊断, 获得高检测敏感性, 无交叉反应的检测方法.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清

日本血吸虫虫卵(由湖南省血吸虫病防治所提供), 急性血吸虫病血清26, 慢性血吸虫病血清32份, 肝吸虫病血清12份, 肺吸虫病血清15份(由湖南省血吸虫病防治所提供), 健康人血清60份, 感染日本血吸虫小鼠血清50份, 正常小鼠血清50份.

1.1.2 动物

新西兰兔, 小鼠由中南大学实验动物中心提供.

1.1.3 日本血吸虫感染阳性钉螺

由湖南省血吸虫病防治研究所提供.

1.1.4 主要试剂

HRP-Protein A进口分装, TMB由上海华美生物工程公司提供, 磁珠和磁力架由长春博得生物工程有限公司提供, 丙烯酰胺, 双丙烯酰胺, 过硫酸铵为进口分装, TEMED由上海华美生物工程公司提供.

1.2 方法

1.2.1 日本血吸虫虫卵和成虫可溶性抗原收集

成年新西兰兔10只, 用常规方法感染, 每只感染1000条日本血吸虫尾蚴, 于35天后处死白兔, 收集血清, 用Protein A agarose纯化抗体; 解剖取肝脏, 低速匀浆, 260目过滤, 收集虫卵; 取纯化虫卵0.2克,研磨, 生理盐水提取可溶性抗原, 冲洗门静脉, 收集成虫, 液氮研磨, 提取可溶性抗原, 将虫卵可溶性抗原和成虫可溶性抗原混合.

1.2.2 可溶性抗原免疫亲和纯化

纯化的抗体用PBS透析, 将纯化抗体固定到磁珠制备成免疫磁珠, 将免疫磁珠和可溶性抗原杂交, 收集沉淀, 洗脱, 收集抗原, 加上样缓冲液变性, SDS-PAGE分离.

1.2.3 可溶性抗原鉴定

SDS-PAGE分离可溶性抗原蛋白条带切取, 洗涤脱色, Trypsin胶内酶解37℃酶解过夜, 回收酶解产物, ESI-MS/MS鉴定酶解产物, 数据库扫描, 确定抗原信息.

1.2.4 抗原生物信息学分析

选取坚定的抗原在生物信息学软件DNAstar上进行抗原分析, 选取高免疫原性抗原片段进行blastp分析, 选取高特异性抗原片段.

1.2.5 抗原片段合成

生物信息学分析获得的高免疫原性、高特异性抗原片段采用Fmoc法进行多肽固相合成, 合成的多肽片段用RP-HPLC纯化, MALDI-TOF鉴定, 确定合成多肽正确.

1.2.6 单个多肽片段ELISA分析

氨基磁珠500μL, 磁力作用下去上清, 加入5%的戊二醛溶液醛化1h,磁力作用下去上清, 洗涤磁珠; 取50mg合成多肽溶解在1000μL 0.01mol/L的PBS溶液中, pH7.4, 偶联1 h, 磁力作用下去上清, 洗涤3次;相同作用条件下取1%的BSA封闭1 h, 磁力作用下去上清, 洗涤3次, 即为磁珠多肽. 取血吸虫阳性兔血清标本20份, 阴性兔血清标本20份进行磁珠多肽评价, 取磁珠多肽10 μL, 磁力作用5min下去上清, 加50μL血清样品, 37℃温育30min, 磁力作用5min下去上清, 洗涤3次, 加入HRP-Protein A工作液50μL, 轻轻混匀, 37℃温育30min, 磁力作用下去上清, 加入50μL底物显色液, 37℃温育15 min, 加入150μL反应终止液, 磁力作用下10 min取上清, 酶标仪上测定OD值.

日本血吸虫虫卵和成虫可溶性抗原亲和纯化SDS-PAGE图

1.2.7 磁珠多肽组合物-ELISA分析

氨基磁珠5000μL, 磁力作用下去上清, 加入5%的戊二醛溶液醛化1h, 磁力作用下去上清, 洗涤磁珠; 取500mg按等质量比混合的合成多肽混合物溶解在1000μL0.01mol/L的PBS溶液中, pH7.4, 偶联1h, 磁力作用下去上清, 洗涤3次; 相同作用条件下取1%的BSA封闭1h, 磁力作用下去上清, 洗涤3次, 即为磁珠多肽组合物. 取血吸虫病急性患者血清26份, 慢性患者血清32份, 肝吸虫病患者血清12份, 肺吸虫病患者血清15份, 健康人血清60份, 进行ELISA分析, 分析方法同上.

2 结果

2.1 日本血吸虫可溶性抗原免疫纯化结果

纯化的感染日本血吸虫阳性血清偶联至磁珠后与日本血吸虫虫卵和成虫可溶性抗原免疫亲和纯化, SDS-PAGE分离, 结果如图所示. 可溶性抗原免疫亲和纯化, SDS-PAGE分离, 酶解后进行数据库扫描, 获得结果见表1.

表1 Mascot数据库扫描获得的部分蛋白信息

2.2 磁珠多肽组合物-ELISA分析

虫卵可溶性蛋白经生物信息学分析获得抗原肽经固相多肽合成, RP-HPLC纯化, MALDI-TOF分析, 证实合成正确, 偶联至磁珠进行单个多肽磁珠-ELISA分析, 确定4个肽可用于进行ELISA分析, 20份阳性兔血清全部为阳性, 20份兔阴性血清全部为阴性, 说明4个多肽可用于进行血吸虫病检测, 将多肽组合物制备成磁珠多肽组合物进行ELISA检测, 检测结果见表2.

表2 磁珠多肽组合物-ELISA法检测结果

3 讨论

检测血吸虫病病人血清中特异性抗体的方法是血吸虫病检测开展最早、使用最广泛的检测方法, 也是目前实验室研究最多的方法. 开展血吸虫病特异性抗体的检测, 主要是特异性抗原的制备. 目前市场上使用最多的是血吸虫虫卵可溶性抗原,用虫卵抗原作为俘获抗原, 敏感性高, 但特异性不强. 现在各实验室主要寻找特异性抗原并进行分子生物学表达来获得俘获抗原, 然而重组抗原难于获得高纯度抗原, 从而导致重组抗原在免疫分析时特异性较差[4]. 至今尚未找到一种既有高特异性和敏感性, 又容易表达获得的分子. 本实验运用蛋白质组学方法分析血吸虫虫卵和成虫抗原, 并对获得的抗原进行生物信息学分析, 获得多条具有高特异性和高免疫原性多肽片段, 并通过实验筛选获得可以作为俘获抗原的多肽组合物, 结合免疫磁珠技术, 获得的磁珠多肽组合物-ELISA方法完全可以进行血吸虫病检测.

[1] 曾小军, 陈红根, 袁建华, 等. 快速胶体金免疫层析法的建立及其对血吸虫病的诊断效果[J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2005, 17(1): 24～27

[2] 沈 健. 虫卵组分抗原ELISA诊断血吸虫病的临床价值[J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2000, 12(6):371～373

[3] 朱明东, 洪玲娣, 卓敏敏, 等. 日本血吸虫虫卵分离方法的改进[J]. 中国血吸虫病防治杂志, 1998,10(3):170～171

[4] Ham ilton JV, KlinertM , DoenhoffMJ.Diagnosis of schistosomiasis: antibody detection, with notes on parasitological and antigen detection methods[J]. Parasito logy, 1998, 117( supp l) : 41257

A Preliminary Study of Peptide Composition for the Diagnosis of Schistosomiasis

LIU Yu
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan College of Science and Technology, Yueyang 414006, China)

Magnetic peptides ELISA for diagnosis of schitosomiasis is established by using the SEA and AWA peptides as the target antigens from proteomics and bilinformatics. It is shown that the sensitivity of magnetic peptides ELISA is 96.15% in the acute cause of Schitosomiasis and 93.75% in the chronic cause of Schitosomiasis. The cross-reaction rates are not exist in the clonorchiasis cases and paragonimiasis cases. This method is a simple assay with higher sensitivity and specificity method and for application Schitosomiasis diagnosis.

Magnetic peptides; Schitosomiasis; ELISA

R383. 2+4

A

1672-5298(2010)03-0060-03

2010-05-04

湖南省教育厅青年基金项目(07Y029)

刘 宇(1972- ), 男, 湖南益阳人, 湖南理工学院化学化工学院副教授. 主要研究方向: 蛋白质结构与功能研究