山西省北冬虫夏草优良菌株与母种培养基的筛选

程红艳，郭 伟，常明昌,3，孟俊龙,3

（1.山西农业大学资源与环境学院，山西太谷030801；2.山西省食用菌工程技术研究中心，山西太谷030801；3.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801）

北冬虫夏草又名北虫草、蛹虫草，属于子囊菌亚门（Ascomycotina）麦角菌（Clavicipitaceae）虫草属（Cordyceps）的模式种，学名为Cordyceps militaris[1]。北冬虫夏草是一种珍贵的药食同源大型真菌，在分类学上与冬虫夏草同归属于虫草属，药理作用与冬虫夏草相似。由于野生虫草资源极为有限，远不能满足日益增加的市场需求[2]。目前，人工栽培技术已获得成功[3-6]。

本研究旨在驯化筛选培育出适合山西省乃至北方地区栽培的优良北冬虫夏草菌种，为山西省工业化栽培生产北冬虫夏草提供理论基础和实践依据[7]。

1 材料和方法

1.1 北冬虫夏草优良菌株的筛选

1.1.1 供试菌株 1号菌株C1（吉林桑蚕研究所）；2号菌株C2（沈阳农科院）；3号菌株C3（山东夏津菌业）；4号菌株C4（华中农业大学菌种中心）。

1.1.2 试验培养基 （1）斜面培养基：加富PDA培养基（马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，琼脂 2%）。（2）一级液体种子培养基：马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨 1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%。（3）罐头瓶栽培培养基：麦粒35 g+营养液50 mL（马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，维生素 B10.01%）。

试验前将引进的北冬虫夏草母种活化，分别转接到加富PDA培养基斜面上进行复壮和扩大培养。

1.1.3 试验方法

1.1.3.1 拮抗试验 采用加富PDA培养基。将4个供试菌株交叉配对接种于同一培养皿上，于25℃培养，观察菌丝相接触部分有无拮抗线，以鉴定是否存在重复菌株。

1.1.3.2 出草试验

1.1.3.2.1 栽培步骤 （1）一级液体种子的制作：用250 mL的三角瓶装100 mL一级种子培养基，于 0.098 MPa（1.0 kg/cm2）的压力下，温度 121 ℃，灭菌0.5 h，冷却后接入复壮的母种（1支试管菌种接种5瓶），25℃恒温振荡暗培养5 d，待用。

（2）装料与封口：以500 mL罐头瓶为栽培容器，加入以麦粒为主的培养料和一定量营养液，用聚丙烯薄膜覆盖瓶口，然后用橡皮筋套住封口。

（3）灭菌与接种：将装料封口的罐头瓶置于高压锅内，并在 0.147 MPa（1.5 kg/cm2）的压力下，温度129℃，灭菌2 h，冷却至25℃左右时，接入一级液体菌种。接种量一般为每瓶10 mL。

（4）菌丝体培养：将接种后的罐头瓶置于25℃的环境中进行绝对避光培养。

（5）诱导子实体形成：待菌丝体吃透培养基后，移入20～25℃的环境中进行光照培养，要求环境中光线充足，光线最好是从瓶的顶部射入，每天光照10 h以上，光强500 lx，当菌丝变为橘黄色时，在薄膜上扎小孔进行通气，以保持湿度为70%～85%。

（6）采收：待子实体长到6～8 cm，其顶部出现许多小刺时，表明北冬虫夏草已经成熟，即可采收。

1.1.3.2.2 试验设计 将供试菌株按1.1.3.2.1栽培步骤进行瓶栽试验，各菌株设置重复20瓶。栽培过程中，观察和记录出草时间、菌丝体长势、子实体品质、产量和生物学效率。

1.2 北冬虫夏草母种培养基的筛选

1.2.1 供试菌株 其为1.1中筛选的优良菌株。1.2.2 母种培养基 其组成成分如表1所示。

表1 5种母种培养基的组成成分 %

1.2.3 试验方法 将1.1中筛选的最优北冬虫夏草复壮菌株沿菌落边缘切下0.5 cm2的菌块，接种到待筛选的5种母种培养基试管斜面上。每一母种培养基接7管，25℃恒温培养，定时观察菌丝长势（菌丝形态、色泽、密度），记录满管天数和平均生长速率。

2 结果与分析

2.1 北冬虫夏草优良菌株的筛选

2.1.1 拮抗试验 试验结果表明，C1，C2，C3和C44个供试菌株生长良好，两两间拮抗线明显，证明没有重复，为4个不同品种。

2.1.2 出草试验 从表2可以看出，4个品种的菌丝体在麦粒培养料上都可以生长，但吃透培养料的时间有所差异，封瓶时间最早的是C1。经新复极差试验可知，C1的菌丝生长势高于其他3种，C3没有进行原基分化，C1的平均单瓶子实体产量最高，生物学效率为71.5%，明显高于C2和C4，而且子实体粗、长，长势均一。因此，供试的4个北冬虫夏草菌株中，生物学特性以C1为最优，将其用于以后的生产和试验。

表2 北冬虫夏草4个菌株间生育特性比较

2.2 北冬虫夏草母种培养基的筛选

不同培养基北冬虫夏草中菌丝的生长速度列于表3。北冬虫夏草菌丝在5种母种培养基中的生长速度不同，菌丝平均生长速度由快到慢的顺序依次是培养基B→A→C→E→D。多重比较表明，菌丝在培养基A中的生长速度和在培养基B，C，E中的生长速度差异不显著，菌丝在培养基B中的生长速度略高于在培养基A，C，E中的生长速度，显著高于在培养基D中的生长速度。北冬虫夏草菌丝在培养基B中的生长速度最快，在培养基D中的生长速度最慢（表4）。

表3 北冬虫夏草菌丝在5种母种培养基中的生长速度 cm/d

表4 北冬虫夏草菌丝在5种母种培养基中生长速度的差异

北冬虫夏草菌丝在选定的5种培养基中培养，生长状况不尽相同。从菌丝密度、菌落边缘整齐度、气生菌丝量、菌丝生长势方面观察北冬虫夏草菌丝的生长状况，结果列于表5。在培养基A和B上，北冬虫夏草菌丝稠密、粗壮、菌落边缘整齐、气生菌丝量适中，但由于北冬虫夏草菌丝在培养基B中的生长速度最快，因此我们将B培养基选定为最优母种培养基，配方是：马铃薯20%，蔗糖2%，蛋白胨2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，琼脂2%。

表5 不同培养基配方对北冬虫夏草菌丝生长状况的影响

3 结论与讨论

3.1 结论

（1）在4个供试菌株中，拮抗试验和出草试验结果表明，由吉林桑蚕研究所引进的C1菌株在生长势、子实体品质、子实体产量和生物学效率方面明显优于其他3个菌株，适合在山西省进行栽培和推广。

（2）在供试的5个母种培养基基础上，筛选出的最适母种培养基配方为马铃薯20%，蔗糖2%，蛋白胨2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，琼脂2%。

3.2 讨论

由于我国推广北冬虫夏草栽培的时间较短，菌种多数从野生菌体中分离纯化而得，很少进行孢子选育等稳定性育种工作。本试验的菌株也存在这种情况，菌株间表现差异大，种性容易出现变异和退化，所以北冬虫夏草育种工作亟待加强。另一方面，在现有基础上，北冬虫夏草商业化栽培时常出现同一品种菌株在不同季节、不同批次表现出很大差异，甚至同一批次还会出现部分培养基不产子座的现象。其中，菌种退化、寿命短、难保存是其最突出的问题，它们直接制约着北冬虫夏草的栽培和生产。因为北冬虫夏草对生长基质及生态环境与一般食用菌不同，而且长期采用无性繁殖及多次转管的北冬虫夏草菌种，其母种培养基因容易变异，表现为出草畸形甚至不出草，产量和质量都不稳定，生物转化率较低[8]。

目前，对北冬虫夏草的研究热点仍主要集中在人工栽培技术和无性繁殖世代的研究上，探索北冬虫夏草在人工培养基上失活的遗传背景和分子遗传变异基质及有效的保存方法，不仅具有理论价值，亦具有实际价值[9]。所以，菌株的季节性试验、生长条件试验和育种试验具有同等重要的意义。任何一个优良菌种，只有在适宜的生长条件下，生理代谢活动才能正常进行，优良性状才能得以表现。环境条件中最基本的是培养基质[10]。因此，对引进的菌种必须先进行母种培养基筛选试验（以保证母种的质量），在母种培养基的筛选试验中，菌丝生长发育好坏是鉴定环境是否合适的一个重要指标。

［1］ 刘波.中国药用真菌[M].太原：山西人民出版社，1984.

［2］ 常明昌.食用菌栽培 [M].2版.北京：中国农业出版社，2009.

［3］王国栋.冬虫夏草类——生态培植应用[M].北京：科学技术文献出版社，1995．

［4］ 苑贵华.吉林蛹虫草及驯化栽培[J].食用菌，1988（3）：8.

［5］ 李玉春.蛹虫草人工培育技术的研究[J].中南林学院学报，1989，9（2）：212-217.

［6］ 陈国卿.辽宁虫草研究[J].中国林副特产，1989（1）：4-6.

［7］ 田良才，牛天堂，李晋川.关于山西现代农业发展的战略思考[J].山西农业科学，2009，37（9）：38-44.

［8］ 梁宗琦.蛹虫草的无性型及子实体的人工培养研究 [J].西南农业学报，1990，3（2）：1-6.

［9］ 韩秀丽，方亮，周晶，等.虎榛子外生菌根合成与筛选的研究[J].华北农学报，2005，20（2）：101-104.

［10］ 渠继红，罗雯娟，韩晓芳，等.真姬菇原种及袋栽培养基配方的筛选[J].山西农业科学，2010，38（5）：18-20.