转cry3A基因马铃薯外源蛋白表达和对马铃薯甲虫抗性分析

罗晓丽，杨 欣，郭文超，田颖川，付文君，吴家和

（1.山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000；2.中国科学院微生物研究所，国家基因组学重点实验室，北京100101；3.新疆农业科学院植物保护研究所，新疆乌鲁木齐830000；4.新疆伊犁州农业技术推广站，新疆伊犁835000）

马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）对马铃薯的为害极为严重，是世界上重要的毁灭性检疫害虫。马铃薯甲虫分布面积广，遍及亚洲、非洲、欧洲和北美洲的30多个国家和地区，其较强的迁飞扩散能力使马铃薯严重减产。各种物理、化学和生物防治方法应用于消灭马铃薯甲虫的工作中，其中化学防治是最常见的防治方法。但是，马铃薯甲虫对类似砷制剂、有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等杀虫剂产生的抗性快速提高，以至于这些杀虫剂起不到长期的杀虫作用，并且有毒化学物质对人类健康也产生了不小的威胁。在这种情况下，转抗虫基因马铃薯的高效杀虫能力得到大家的青睐。苏云金芽孢杆菌制剂对马铃薯甲虫低龄幼虫杀虫效果较好。Cry3A是从苏云金芽孢杆菌一个亚种B t ssp tenebrionis中分离出来的毒性蛋白，其基因转入马铃薯后产生的毒蛋白对马铃薯甲虫有很好的毒杀功效。Perlak，Adang等[1-2]用合成的cry3A基因转入马铃薯植株中，获得了有效抗马铃薯甲虫的转基因植株。山西省农科院棉花所生物技术实验室也把改造的cry3A基因导入到马铃薯品种紫花白中，获得较好的抗虫效果。

本研究对4个转基因马铃薯株系外源毒蛋白的表达量及其对马铃薯甲虫的抗性进行分析，并对高抗马铃薯甲虫的转基因株系C3-9的田间抗虫性和产量进行评价。

1 材料和方法

1.1 材料

供试品种：对照为新疆当地主栽品种紫花白，4个转cry3A基因株系由山西省农科院棉花所生物技术实验室培育，其转化受体亲本也为紫花白。

虫卵取自新疆玛纳斯县农业技术推广站试验地，将采集的二代马铃薯甲虫卵，放置在湿润的培养皿内孵化幼虫。

1.2 ELISA检测方法

每个材料取50 mg叶片，液氮研磨成粉状，蛋白提取、包被和显色参照Bt-Cry3A ELISA Complete Kit（PSA 05900/0288，Agdia，Inc）标准程序进行。用1 mL MEB研磨成匀浆，置于1.5 mL EP管离心，提取出总蛋白。在405 nm下，用酶标仪（BIO-RAD680）测量Cry3A的浓度。

1.3 离体叶片饲喂马铃薯甲虫试验和田间抗虫性调查

马铃薯材料于2009年种植在新疆农业科学院植保所安宁渠试验基地和伊犁特克斯县农技站试验地，4个转基因株系和对照（CK1）按随机区组排列设计，3个重复，不喷施任何农药。附近种植的对照（CK2）喷施农药防治马铃薯甲虫。其他栽培措施均一致。

1.3.1 实验室饲喂马铃薯甲虫 试验于2009年7月在新疆农业科学院植保所安宁渠试验基地的实验室内常温下进行。将取自新疆玛纳斯县农业技术推广站试验地的二代马铃薯甲虫卵块置于室温保湿环境下，待其孵化，用毛笔轻挑取初孵幼虫，置于直径为10 cm的培养皿中，每个培养皿为1个处理，供试的活虫数10头。同时采集一定数量的4个转基因株系和对照的幼嫩叶片，将这些叶片的叶柄用棉球或吸水纸包裹起来。每个处理的嫩叶置于相应编号的培养皿内，4龄幼虫老熟后移至有沙土的塑料杯内饲养，每日更换新鲜叶片，对各龄期幼虫在不同转基因株系上的发育及死亡情况进行记载。

1.3.2 田间抗虫性调查 在新疆伊犁特克斯县农技站试验地对转基因马铃薯的抗性进行调查。发生动态调查采用定点定株调查方法，越冬代成虫开始出现时，在每小区3点取样，每点连续选取5株并挂牌。统计挂牌株马铃薯甲虫卵、幼虫和成虫数量。之后每7 d调查1次，对不同转基因株系上的马铃薯甲虫的自然减退率、发育期及为害情况进行记载。根据马铃薯生长的不同时期分2次调查，最后统计马铃薯为害率。测产时各小区随即选3点，每点连续5株，求出单株的平均产量。

2 结果与分析

2.1 转基因马铃薯株系的Cry3A表达量分析

为了对不同转基因株系的Cry3A表达量进行定量分析，试验从田间采取幼嫩的叶片进行ELISA分析。结果表明，4个转基因株系均有外源蛋白的表达，但表达量差异显著，相对紫花白对照来说，4个转基因的表达量变幅为1.4～9.0 μg/mg（图 1）。其中，C3-9株系的表达量最高，C3-6株系的表达量最低。

2.2 转基因马铃薯的抗虫性分析和产量评价

2.2.1 转基因马铃薯株系离体叶片饲喂马铃薯甲虫分析 对4个转基因株系和对照叶片的离体饲喂马铃薯甲虫的试验结果表明，抗虫转基因株系叶片对马铃薯甲虫具有毒杀、滞育等作用（表1）。其中，C3-9株系在饲喂6 d后，马铃薯甲虫全部死亡，而其他3个株系虽然有一定的毒杀效果，但还不能达到大面积应用的效果。究其原因，可能是C3-9表达的外源蛋白量远高于其他3个株系，其叶片含毒蛋白水平达到完全毒杀马铃薯甲虫的剂量。从表1还可看出，其他3个转基因株系在马铃薯甲虫不同龄期的致死率均显著高于对照，同时对幸存的马铃薯甲虫的发育具有滞育性。

表1 马铃薯甲虫各龄期幼虫在不同转基因株系上的发育及死亡情况

2.2.2 转基因株系田间抗虫性和产量评价 分别于2009年6月23日和7月7日对田间马铃薯甲虫为害状况进行调查（表2）。6月份调查时发现，对照为害严重，少许不完整叶片上存在大量的马铃薯甲虫，但C3-9转基因株系叶片基本无为害，其上的马铃薯甲虫很少，且多为很小的若虫。其他3个转基因株系也遭到不同程度的为害，其叶片不完整，但有较多叶片，所以百株虫口数反而高于对照。7月初调查发现，对照仅剩光秆，可C3-9仍然无为害，但其他3个转基因株系的为害也很严重。

表2 转基因马铃薯株系2个生育时期虫口数和为害情况

后期对所收获的马铃薯块茎进行测产。由于对照（CK1）为害严重，基本无产量，只好使用喷药的对照（CK2）进行测产（图2）。C3-9小区产量和喷药对照很接近，其他株系也受到马铃薯甲虫的为害，减产严重。

3 讨论

通过ELISA方法对4个转cry3A基因马铃薯品系表达蛋白量进行研究，发现4个转基因品系中，C3-9的表达量最高，其余依次为C3v-5，C3-11，C3-6。为进一步证实4个转基因马铃薯品系的抗虫效果，采用对幼虫死亡率、虫口自然减退率和产量分析的方法进行研究，结果表明，C3-9品系表现出高的抗虫性，其叶片的外源毒蛋白含量也显著高于其他转基因品系。这说明外源抗虫蛋白的表达量和抗虫性是呈正相关的，与报道的转基因抗虫棉花、水稻和玉米等结果一致[3-10]。

4个转基因株系的农艺性状表现和对照紫花白是一致的。在不喷洒杀虫农药时，C3-9具有高抗虫性，其产量和喷洒农药的对照相当。而C3v-5，C3-11和C3-6抗虫效果还不够理想，根本原因是其毒蛋白的表达量较低造成的。山西省农科院棉花所培育的C3-9可以直接作为高抗马铃薯甲虫的品种进行试种，或者作为育种材料来培育大量的抗虫马铃薯品种。

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