利用脱细胞血管基质体外构建小口径组织工程血管

2010-09-19武欣谷涌泉段红永陈兵李建新吴英锋张淑文汪忠镐张建

中国实验动物学报 2010年5期

关键词：剪切力平滑肌胶原

武欣，谷涌泉，段红永，陈兵，李建新，吴英锋，张淑文，汪忠镐，张建

(首都医科大学宣武医院血管外科，北京 100053)

利用脱细胞血管基质体外构建小口径组织工程血管

武欣，谷涌泉，段红永，陈兵，李建新，吴英锋，张淑文，汪忠镐，张建

(首都医科大学宣武医院血管外科，北京 100053)

目的探讨利用犬的间充质干细胞诱导分化种子细胞，以异种脱细胞血管基质为基础体外构建小口径血管移植物。方法采用密度梯度离心和贴壁培养的方法从犬骨髓中分离出间充质干细胞并体外培养，诱导分化成内皮样细胞和平滑肌样细胞;采用非离子型去垢剂和胰蛋白酶去除猪颈动脉血管壁结构细胞，对脱细胞基质进行组织学、力学检测及孔隙率评估。在生物反应器内采用旋转种植的方法将犬骨髓间充质干细胞诱导的内皮样细胞种植到脱细胞基质上，体外构建小口径组织工程血管。结果犬的骨髓间充质干细胞体外能够定向诱导分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞，可以作为血管组织工程的种子细胞。经过脱细胞处理后，光镜和电镜观察证实血管壁的细胞成分完全去除。具有良好的孔径和孔隙率。支架在生物力学、孔隙率等方面符合构建组织工程血管支架的要求。在生物反应器内剪切力条件下可以初步构建出组织工程血管。结论小口径血管移植物可以将间充质干细胞诱导种子细胞，以异种脱细胞血管支架作为基质，在搏动性生物反应器内培养的方法进行构建。

间充质干细胞;脱细胞;支架;生物反应器;组织工程

血管疾病是世界上发病率最高的疾病之一，其主要的治疗手段就是血管移植术。目前，血管移植术的主要适应证有:晚期的动脉粥样硬化性疾病、血管瘤性疾病、血管先天缺陷性疾病和创伤等。因此血管移植物的来源就成为人们关注的重要课题。目前临床上应用的血管移植物主要有三个来源:①自体血管;②异体血管;③人工材料。自体血管，包括大隐静脉和内乳动脉，组织相容性好，无免疫排异反应，仍是血管移植物的“金标准”。但是动脉血管的供体有限，静脉血管舒缩性差，易于形成血栓及血管瘤，静脉或动脉的取材部位留下创口，形成二次创伤，因此其临床应用受到限制。异体血管包括异种血管和同种血管。异种血管来源虽然丰富，但移植后会产生强烈的超急性免疫排异，致使血管壁增生、血栓形成而使移植血管腔闭塞。同种血管存在供体不足及免疫排斥反应的问题。人工血管移植物对于小口径动脉移植的长期通畅率也不是十分满意。所有这些原因，使我们意识到临床需要小口径血管替代物的重要性。

组织工程学的兴起为从根本上解决以上问题带来了新的曙光。1987年美国国家科学基金会正式提出和确定组织工程这一概念［1］，核心是利用细胞生物学和工程学原理，在体外培养、扩增种子细胞，种植于生物相容性好、并可降解的生物材料上，形成细胞—生物材料复合物，植入体内与宿主组织融合生长，以达到对宿主组织结构的修复和功能重建。

本研究采用以去垢剂和胰蛋白酶联合的脱细胞方法制备的脱细胞血管基质作为支架，以从犬骨髓分离培养的间充质干细胞诱导分化的内皮样细胞作为种子细胞，并在搏动性生物反应器内培养的方法进行构建。

1 材料与方法

1.1 种子细胞的培养与鉴定

1.1.1 犬的骨髓间充质干细胞分离培养:取健康成年杂种犬，由北京市科宇实验动物养殖中心提供［SCXK(京)2000－0015，动物饲养级别 1 级］，雌雄不限，平均体质量在(15±1.5)kg左右。速眠新II注射液和安定注射液1∶1混匀肌内注射麻醉后。无菌条件下，以肝素预润的16号骨穿针穿刺髂前上棘，抽取骨髓10 mL。加入肝素抗凝(每毫升骨髓加入肝素100 U)，以等体积的PBS充分混匀，4℃条件下转入离心管中，取20 mL淋巴细胞分离液(Ficoll，1.077 g/L，Sigma)，将稀释骨髓按1∶1小心加在分离液的界面上。用水平离心机以1500 r/min离心30 min后，取中层云雾状单个核细胞层，加PBS反复离心洗涤3次，每次2000 r/min离心5 min。将分离的单个核细胞按1×104/cm2密度接种于预先用明胶(0.2%)衬底的 25 cm2培养瓶，用含有 LG－DMEM和FBS(比例为9∶1)混匀培养液悬浮，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。

1.1.2 犬的骨髓间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞和平滑肌样细胞:将分离的骨髓单个核细胞分别按1×104/cm2密度接种于预先用明胶(0.2%)衬底的25 cm2培养瓶，内皮样细胞以内皮样细胞诱导培养液 EBM－2培养液(Lonza，包含 5% FBS、VEGF、hFGF－b、IGF－1、hEGF、hydrocortisone 和ascorbic acid)悬浮，平滑肌样细胞以诱导培养基(DMEM培养液含 10%的胎牛血清、PDGF－BB 5 μg/L、TGF－β1 2 μg/L、IGF－1 5 μg/L、100 U/mL 青霉素、100 g/L链霉素)重悬，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱培养，48 h后轻轻换液弃去未贴壁细胞，以后每隔2 d更换培养液。待细胞生长至80%～90%汇合时，以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液消化，传代培养。每天倒置相差显微镜下观察细胞的形态特征。

1.1.3 诱导分化的内皮样细胞、平滑肌样细胞免疫化学鉴定:免疫荧光鉴定方法为把诱导的内皮样细胞、平滑肌样细胞以1×104/cm2的密度接种于24孔板内，隔日换液。每天在倒置相差显微镜下观察细胞的形态特征。36 h待细胞达到完全贴附后进行鉴定。内皮样细胞进行 CD31和 VIII因子(1∶200)特异性抗体鉴定，平滑肌样细胞则进行 α－SMA(1∶400)、SMMHC(1∶500)特异性抗体鉴定。

1.2 脱细胞基质的制备与检测

1.2.1 脱细胞基质的制备:脱细胞方法基于Kaushal等［2］所描述的方法，并对其进行了部分改进。具体为:将获得的猪颈血管放在蒸馏水中1 h，以去除血液成分。然后将血管放入到含0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA(Sigma)中37℃恒温水槽处理6 h，然后将血管放入到含有 1% Triton X－100(Sigma)和0.1%氨水的PBS中，放置于脱色摇床上(30 r/min)，4℃条件下振荡处理72 h。每日更换脱细胞溶液。

1.2.2 组织学观察:取新鲜的猪颈动脉和制备得到的血管脱细胞基质，用4%甲醛固定，石蜡包埋后切片以进行苏木精－伊红(HE)染色、Masson三色法检测胞外基质结构的完整性。

脱细胞血管基质，用2%戊二醛固定后，用无菌PBS冲洗3遍后，冻干抽真空。标本送检北京师范大学电镜测试中心，进行扫描电镜检查，观察脱细胞基质的脱细胞效果和孔径大小。

1.2.3 爆破强度与缝合强度检测:将脱细胞血管基质标本进行移植前的力学性能检测，包括爆破强度(burst strength)、缝合强度，并与正常猪的颈动脉进行对照。

1.2.4 孔隙率检测:新鲜猪颈动脉及脱细胞血管基质标本经真空冻干后进行孔隙率检测。孔隙率测定采用Autopore IV 9510压汞仪，压力范围0.5～6000 Pa。测试样本包括3组脱细胞血管和正常猪的颈动脉作为对照。

1.2.5 脱细胞基质组织胶原含量测定:胶原是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的主要蛋白质成份，约占机体总蛋白的 25%。羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)为非必需氨基酸，是构成胶原组织主要成分，含量相对稳定，约占胶原氨基酸总量的10%，是衡量组织胶原含量的特异性指标之一［3］。因此，测定HYP的量能确定组织中胶原的含量。我们采用胃酶酸解法对脱细胞三组样本(每组3个样本)与自然正常猪的颈动脉(3个样本)进行了测试。

1.3 生物反应器下脱细胞支架内皮细胞的动态种植

将脱细胞支架材料用75%酒精浸泡1 h消毒后，用无菌PBS冲洗浸泡3遍，每次1 h，以去除消毒酒精。将消毒好的脱细胞支架置于无菌离心管内，用EBM－2培养液浸泡12 h。将消化计数好的诱导分化的内皮细胞按照1×105/cm2的密度将细胞悬液注入到管状支架的腔内，两端封闭。置入培养箱内旋转种植3 h，转速为5～6 r/h。灌流液体选用EBM－2培养液，通过调节蠕动泵转速调节流量，进而调节反应器的剪切力。采用逐渐增加剪切力的方式，1 d内逐渐将剪切力由 1 dyn/cm2增加至 10 dyn/cm2，然后在10 dyn/cm2剪切力条件下继续培养2 d。同时以在脱细胞支架上静态培养3 d的内皮细胞的血管支架作为对照。标本取材，留取 HE染色和扫描电镜检查样本。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 诱导分化种子细胞的结果

分离获得的骨髓MSCs经培养液培养后，培养48 h，可见贴壁细胞呈集落样生长，细胞呈长梭形、三角形、纺锤形或不规则形，核分裂相明显。此后，细胞生长迅速，集落边缘细胞呈纺锤形近似单层生长，集落中心则细胞密集呈复层生长。诱导内皮样细胞加EBM－2完全培养基诱导培养24 h后，牢固贴附在培养瓶底，初为圆形或椭圆形，多呈小团集落存在，24 h后牢固贴附在培养瓶底。培养2～3 d细胞生长迅速，集落增大，并开始汇合形成排列较疏松的单细胞，此时细胞较大，有明显的椭圆形核，常有2～5个核仁。6～8 d完全汇合形成连续的单层细胞，汇合成片后外观呈“鹅卵石”样形态。诱导的血管平滑肌样细胞多数呈圆形。接种于培养瓶中约4 h贴壁，培养24 h后，可见细胞呈三角形或梭形，有少量突起;3 d细胞开始增殖;7 d左右细胞密集，呈峰谷样生长。平滑肌细胞有一卵圆形或圆形明亮的核，核中有1～4个大小不一深色的核仁，细胞质丰富，含少量颗粒。细胞逐渐伸展，透明度增高，周界不清，突起相互接触，平等排列成束，密集与稀疏处相互交错成“峰谷”状。

内皮样细胞、平滑肌样细胞的免疫荧光鉴定:内皮样细胞VIII因子，CD31染色阳性，着色位于细胞核周围，诱导分化的内皮细胞呈阳性(图1，彩插2);平滑肌样细胞 α－actin、calponin及 SMMHC染色阳性(图2见彩插2，图3见彩插3)。

2.2 脱细胞支架

2.2.1 形态:形态学观察:猪颈动脉经脱细胞处理后外观呈乳白色，外表面呈微绒毛状，管壁弹性良好无塌陷，管腔内表面光滑。

2.2.2 脱细胞支架检测:组织切片的HE染色结果表明，猪颈血管的细胞的破裂，支架中已经没有可见核染，细胞成分被完全清除。胰酶处理6 h，细胞基质的结构有所破坏，内弹力板部分断裂。随后的Masson染色结果也表明，基质中蓝染的胶原纤维结构完整，红色的细胞成分基本被除，同时以自然猪的颈动脉作为对照进行HE、Masson染色(图4、5，彩插3)。扫描电镜结果表明脱细胞基质内膜面没有内皮细胞及其残余成分，胰酶处理6 h，内弹力板可见大小不等孔隙，横切面可见脱细胞基质为疏松多孔结构，孔径最大平均为99.2 μm(图6)。

图6 脱细胞基质内膜面(a)与侧面扫描电镜(b)Fig.6 SEM appearance of decellularized arterial matrix.a.The intimal surface;b.the lateral surface.

2.2.3 生物力学检测:①爆破强度:为了了解自体活组织管是否具有足够的强度能够耐受生理的张力，我们进行爆破强度检测，以了解该材料破裂前所能承受的最大压力。对5根脱细胞基质进行了测试，5根未处理的自然颈动脉作为对照。统计学分析，采用独立样本t检验，与自然血管比较，脱细胞基质爆破强度P值为 0.073(P＞0.05)，两者爆破强度无统计学差异。②缝合耐受强度:每个标本测试3次，对5根脱细胞基质进行了测试，5根未处理的自然颈动脉作为对照，每组结果以均数±标准差(±s)表示。两者的强度接近(P＞0.05)，提示本组活组织生物管具有足够的可缝合强度，能够耐受在体的端端吻合操作。见表1。

表1 脱细胞基质和自然血管的力学与胶原含量测定比较(±s)Tab.1 Comparison of the mechanical properties and collagen content of decellularized arterial matrix and natural artery

Collagen content脱细胞基质(Decellularized arterial matrix)胶原含量(mg/g)(n=3)组别Group爆破强度(mmHg)(n=5)Bursting strength缝合强度(N)(n=5)Suture strength 1863±83 2.80±0.27 186±11自然血管(Natural carotid artery)1955±97 3.04±0.19 293±18

2.2.4 脱细胞基质胶原含量测定:取脱细胞基质3个样本与自然血管3个样本，进行了组织动脉HYP(胶原)含量测定，从而计算出动脉支架的胶原含量数值［3］。胶原含量与自然血管均有明显统计学差异(P＜0.001)。统计学分析，采用独立样本 t检验，与自然血管比较，脱细胞基质爆破强度P值为0.073，缝合强度三组 P值为 0.064，二者均 P ＞0.05。胶原含量与自然血管均有明显统计学差异(P＜0.001)。见表1。

2.2.5 孔隙率的检测:自然血管的孔隙率为64.2%，脱细胞基质的孔隙率为94.93%。

2.3 反应器下组织工程血管构建

血管脱细胞基质旋转种植3 h后反应器动态培养3 d，HE染色可见脱细胞基质内表面整齐排列一层有核细胞形态(图7，彩插3);扫描电镜结果可见基质的管腔面基本为种植的EC覆盖，部分细胞伸展入基质内弹力层，细胞伸展，排列方向与培养液流动方向一致。相同密度的内皮细胞静态种植3 d后的扫描电镜可见细胞贴附在基质的管腔面生长，成片状，细胞排列杂乱(图8)。

图8 静态种植(a)与(b)体外构建内膜面扫描电镜Fig.8 SEM appearance of the inner surface of the grafts.a.static cultivation;b.in vitro construction

3 讨论

随着各种直径大小的血管移植物在胸心外科手术中的应用，血管移植物的研究成为人们关注的热点。目前对小口径血管移植替代物临床需要很大，但可供使用的小口径替代物又十分缺乏，因此研制一种优良的小口径血管替代品就显得特别迫切［4］。

组织工程学是近年来研究的一个热点领域［5］，有望解决临床小口径移植物短缺的问题［4］。血管组织工程研究的主要内容集中在三个方面:① 种子细胞的培养与生长;② ECM替代物;③组织工程血管三维培养技术的研究。

血管组织工程所应用的种子细胞包括内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。内皮细胞覆盖于血管的内表面，呈单层排列，并能分泌多种血管活性因子如内皮素、前列腺素、一氧化氮(NO)等，具有抑制血小板聚集、抗血栓形成及抗内膜增生的作用［6］，从而保持血管的稳定性。虽然自体来源的血管细胞获取和培养技术都已经较为完善，但是限于个体差异，并非所有患者都有合适的自体静脉可供选择，获取的细胞数量，细胞活力也因人而异。最主要的问题是体外培养和构建的时间过长，难以满足急症患者的需要。并且患者如果并存有动脉硬化或糖尿病时，往往自体来源的内皮细胞存在功能低下的问题，其分裂增殖的能力和分泌细胞因子的能力均下降［7］。

间充质干细胞 (mesenchymal stem cell，MSC)是组织中多能干细胞的混合体，具有来源广泛、取材方便、分化较容易、可分化的组织类型广泛等优点，因而在组织工程方面具有广阔的应用前景。

本实验应用密度梯度离心法联合贴壁培养的方法，成功诱导分离了犬的骨髓间充质干细胞，并进行了传代培养。内皮诱导培养基为 EBM－2完全培养基，平滑肌细胞培养基是含有 PDGF－BB，TGF－β1，IGF－1特定诱导培养基，成功诱导分化成内皮样细胞和平滑肌样细胞，并表现了其特有的细胞形态。诱导分化的内皮细胞样细胞和平滑肌细胞样细胞经过特定的细胞鉴定，CD31和VIII因子在诱导的内皮细胞样细胞均呈明显阳性表达，α－SMA、calponin和SM－MHC在诱导的SMCs的也呈明显阳性表达。

ECM的研究仍是目前研究的重点。脱细胞的异种或同种异体的血管作为小口径组织工程血管具有以下优点:①生物来源的材料，生物相容性大大提高;②可生物降解性，允许受者自身组织的重建:③细胞成分被除去，免疫原性大大降低，炎症反应发生的几率也大大降低;④胞外基质结构保持完整，机械强度较高，同时脱细胞基质相当于合成材料有利于细胞的生长［8］。

本研究采用Kaushal 2001年Nature杂志发表论文的脱细胞基本方法选用酶消化法和非离子去垢剂联合处理，对猪的颈动脉进行脱细胞处理［3］。传统的胰酶处理1 h，Triton X－100和氨水处理72 h，此方法我们发现，脱细胞效果明确，ECM完整，但是获得的脱细胞基质的孔径与孔隙率不足，实验发现，胰酶处理1 h，其孔隙率为65%，孔径为54 μm，无法满足种子细胞种植(尤其是平滑肌细胞种植)的要求。我们采取了不同的探索，如何在保障脱细胞基质适当力学强度的前提下，尽量增大脱细胞基质的孔径。最后我们选择胰酶处理6 h作为时间切入点，实验观察，ECM中无细胞成分，脱细胞的支架结构基本完整，组织学切片观察，内弹力板部分破坏，扫描电镜检测可见内弹力膜有大小不等的孔洞，获得的ECM的最大孔径99.2 μm，孔隙率是94.93%。虽然脱细胞基质的胶原含量有所下降，但随后生物力学检测，其缝合强度与爆破强度相对于自然血管虽略有降低，但统计学无显著性差异。

在血管生长发育过程中，血流动力起重要作用［9，10］。合适的切应力环境有利于血管平滑肌细胞与血管内皮细胞增殖分化，过高切应力则会抑制其生长［11，12］。构建组织工程血管的一大难题在于血管处在一个天然的机械动力环境，它包括:血液流经内皮层的切线产生的切变应力，环形管壁舒缩产生的牵张应力和静水压产生的正常应力。切变应力对血管细胞的形态、增殖、极性及基质的构成和结构有重要的影响。目前用于血管组织工程的生物反应器的研制主要是通过模拟体内的血流动力学条件，旨在体外培育成在结构和功能上与天然血管具有相同作用的人工血管。

本实验采用将犬骨髓分离培养的MSCs诱导分化的ECs为种子细胞，以猪脱细胞血管基质为支架，将 ECs旋转种植到脱细胞基质上，并在模拟血管的搏动性生物反应器内在剪切力的条件下培养，低剪切力条件下完成了小口径组织工程血管构建，实验剪切力的条件，发现在反应器早期，如果过快增加剪切力，不利于内皮细胞的粘附。所以我们采用逐渐增加剪切力的方式，1 d内逐渐将剪切力由1 dyn/cm2增加至10 dyn/cm2，然后在 10 dyn/cm2剪切力条件下继续培养2 d。从构建后血管与未进行反应器种植仅仅内皮细胞粘附的血管基质比较，HE染色与扫描电镜观察，动态反应器下血管内皮细胞粘附较好，细胞平铺整齐，细胞沿着血流方向生长。

本项研究表明小口径组织工程血管移植物可以通过将MSCs诱导分化的内皮细胞作为种子细胞，以脱细胞血管支架作为基质，在搏动性生物反应器内，通过逐渐增加剪切力条件的方法，成功进行体外组织工程小口径血管的构建。

(本文图 1、2见彩插 2，图 3－5、7见彩插 3)

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Preliminary Study of in vitro Construction of Small-Diameter Vascular Graft by Seeding Cells onto Decellullarized Arterial Matrix

WU Xin，GU Yong－quan，DUAN Hong－yong，CHEN Bing，LI Jian－xin，WU Ying－feng，ZHANG Shu－wen，WANG Zhong－gao，ZHANG Jian
Department of Vascular Surgery，Xuan Wu Hospital，Capital University of Medical Sciences，Beijing 100053，China

ObjectiveTo explore the use of canine bone marrow mesenchyme stem cells to induce differentiated seed cells in vitro，and using the seeding cells to develop small－diameter vascular graft based on xenogenic decellularized arterial matrix.MethodsCanine bone marrow mesenchymal stem cells were separated by density gradient centrifugation and cultured in vitro，and differentiated into endothelial cells and smooth muscle cells.Porcine carotid arteries were decellularized using Triton X－100 and tripsin to eliminate all the cellular components.The mechanical and biocompatibility properties of the decellularized scaffolds were identified and evaluated.Small－diameter tissue engineered vascular grafts were constructed using the decellularized scaffolds and seeding cells in the dynamic bioreactor under dynamic conditions.ResultsThe cultured bone marrow mesenchymal stem cells were successfully differentiated into endothelial－like cells and smooth muscle－like cells，which can be used as seeding cells.Porcine carotid arteries were successfully decellularized by trypsin，ammonium hydroxide and non－ionic detergent eliminating all cellular components to make acellular scaffolds.Good pore size and porosity of the acellular scaffold were obtained.The biomechanics，immunogenicity and cell compatibility characteristics of the scaffolds could meet the requirements of tissue engineered vascular graft.Therefore，construction of the tissue engineered vascular graft in vitro in the dynamic bioreactor was succeded.ConclusionsBone marrow mesenchyme stem cells can be induced to differentiated into endothelial－like cells and smooth muscle－like cells in vitro.Using these cells as seeding cells and xenogenic decellularized arterial matrix as acellular scaffolds，small－diameter vasculargrafts can be constructed in a pulsatile bioreactor by culture under dynamic conditions in vitro.

Bone marrow mesenchymal stem cells;Decellularization;Scaffold;Bioreactor;Vascular graft，tissue engineered;Arterial matrix;Dog