CT灌注评价高碳酸血症模型下正常大鼠脑组织血流动力学变化

2010-09-19张家文姚振威刘含秋杨艳梅黎元张清波秦少华冯晓源

中国实验动物学报 2010年5期

关键词：尾状核混合气体高浓度

张家文，姚振威，刘含秋，杨艳梅，黎元，张清波，秦少华，冯晓源

(复旦大学附属华山医院放射科，上海 200040)

CT灌注评价高碳酸血症模型下正常大鼠脑组织血流动力学变化

张家文，姚振威，刘含秋，杨艳梅，黎元，张清波，秦少华，冯晓源

(复旦大学附属华山医院放射科，上海 200040)

目的探讨CT灌注评价高碳酸血症模型下正常大鼠脑组织血流动力学变化的可行性;研究大鼠CT灌注参数变化率与α－SMA表达之间的相关性。方法 10只雄性SD大鼠，体质量250～300 g，在吸入空气和吸入高浓度CO2混合气体(10%CO2和90%空气组成)后15 min，分别使用GE 16层Light Speed CT扫描仪对大鼠脑尾状核层面进行CT灌注扫描，原始图像经GE ADW 4.2工作站Perfusion 3.0脑部灌注软件处理后产生灌注曲线及伪彩图像，两次扫描前均测定大鼠的血液CO2分压、pH值等血气分析指标。检查结束后24 h内，大鼠取脑固定，在尾状核中心层面切片，进行脑组织HE染色及鼠特异性SMA抗体免疫组化染色。应用SPSS11.5统计学软件进行分析:采用配对t检验，比较正常大鼠右侧尾状核在吸入空气和吸入高浓度CO2混合气体后CT灌注参数脑血容量(CBV)、脑血流量(CBF)、血管表面通透性(PS)和平均透过时间(MTT)的变化有无差异;采用Pearson相关分析分别检测大鼠右侧尾状核的SMA阳性血管染色计数与灌注参数CBV和CBF在CO2分压升高前后的变化率相关性。结果所有大鼠在吸入含10%CO2和90%空气的混合气体15 min后，动脉血CO2分压均明显升高 (t=9.39，P＜0.001)，血浆 pH值降低 (t=13.49，P＜0.001)。正常SD大鼠右侧基底节区CBV、CBF、PS每100 g组织分别为(10.28±4.01)mL、(304.95±88.77)mL/min、(0.26±0.37)mL/min，MTT 值为(1.48±0.07)s;吸入 10%CO2和90%空气的混合气体后右侧基底节区CBV、CBF值明显增加，每100 g组织分别为(19.25±8.42)mL(t=4.92，P=0.001)和(507.33±167.94)mL/min(t=6.75，P＜0.001);吸入混合气体前后 CBV、CBF增加百分比分别为(87.14±46.45)%、(65.75±22.05)%;PS及MTT变化不显著(P均＞0.05)。大鼠脑组织 α－SMA阳性染色血管计数为(12.7±3.23)条/高倍视野。Pearson相关分析显示，正常脑组织的 CBV和CBF变化率与其 α－SMA阳性计数之间呈显著相关(r分别为0.652和0.890，P均＜0.05)。结论 CT灌注技术在改变血液CO2分压的条件下可以反映脑组织血流动力学变化;大鼠正常脑组织高碳酸血症前后CT灌注参数变化率与成熟血管数量相关。

大鼠;体层摄影术，X线计算机;灌注;高碳酸血症;平滑肌抗体反应素

正常生理环境下，高碳酸血症可以使脑血管扩张，脑血流量增加;低碳酸血症时脑血管收缩，血流量减少［1］。通过吸入不同含量 CO2混合气体方法可以用于检测脑血管反应性，评价脑血管调节能力［2］。脑血流储备的判断以前主要用于脑血管性疾病的预后风险预测及疗效评价，近年来用于研究脑胶质瘤新生血管功能和成熟度变化［3－5］。研究认为，正常脑组织血管含有完整平滑肌细胞，在高碳酸血症环境下血管扩张，反应敏感;而胶质瘤组织由于具有较多的新生不成熟血管，缺乏完整的平滑肌细胞，血管舒张及收缩能力下降，对 CO2反应敏感度下降。由此，高碳酸血症下脑组织血流状况发生变化与血管平滑肌数量可能相关。其中，MR灌注成像或 BOLD 可以反映脑血流灌注量的变化［5－9］，但是，MR灌注反映相对血流量的变化;而 CT灌注成像是近年来发展起来的新技术［10］，可以定量测定脑血流，并且CT扫描操作简便，在评价脑血流量变化方面有着独到的优势。本实验目的是研究高碳酸血症前后正常大鼠脑组织各项灌注值的变化特征，并与成熟血管标记物－平滑肌抗体反应素(alpha smooth muscle actin，α－SMA)染色阳性血管计数对照，分析CT灌注评价高碳酸血症环境下脑组织血流动力学变化的可行性以及CT灌注参数与成熟血管标记物的相关性。为CT灌注研究脑血流储备以及胶质瘤血管成熟度奠定基础。

1 材料方法

1.1 大鼠高碳酸血症模型的建立

1.1.1 实验动物:雄性 Sprgue Dawley(SD)大鼠10只，体质量250～300 g;购于上海复旦大学实验动物科学部【SCXK(沪)2007－0002】，清洁级。

1.1.2 大鼠麻醉:10%水合氯醛(自配)，以3 mL/(kg·bw)剂量腹腔注射麻醉大鼠。

1.1.3 建立高碳酸血症模型:实验大鼠仰卧，四肢固定，右侧股静脉处2%碘伏消毒，显微镜下用外科手术剪刀及显微镊子暴露股静脉，静脉留置24 G穿刺针用于注射CT造影剂;同时在左侧股动脉留置24 G套管针采集血标本监测血气指标。准备10%CO2和90%空气的混合气体钢瓶，钢瓶压力为10 kPa，容量为40 L，小动物呼吸机进气端接钢瓶，出气端连接自制大鼠面罩，包裹大鼠口鼻，呼吸频率90次/分钟。

1.2 CT扫描程序

1.2.1 CT平扫:大鼠平放于CT检查床，右侧股静脉套管接高压注射器。CT机型为GE 16层 Light Speed扫描仪，先行CT常规平扫，矩阵512×512，管电压100 kV，管电流120 mA，FOV为9.6×9.6 cm，层厚1.25 mm，全脑扫描。

1.2.2 CT灌注成像:CT平扫后，以尾状核层面为中心，在吸入高浓度 CO2前后各行一次CT灌注扫描。CT灌注扫描采用电影模式，每圈0.5 s，层厚1.25 mm × 8层;矩阵512×512，管电压100 kV，管电流120 mA，FOV为9.6 cm ×9.6 cm。经右侧股静脉套管接高压注射器注射非离子型对比剂(Ominipaque 300 mg I/mL)2 mL，注射速率0.5 mL/s;延迟2 s，曝光时间50 s;产生792层大鼠脑冠状面图像。二次扫描间隔时间为60～90 min，CT常规扫描脑内造影剂廓清开始第2次灌注扫描。吸入高浓度CO2混合气前及吸入15 min后，各用肝素化的密封注射器从股动脉采集0.3 mL血液，行 CO2分压和血液pH值等血气指标测定。

1.3 图像后处理及灌注参数计算

采用GE ADW4.2工作站中Perfusion 3.0灌注软件中的脑部程序分析，流入动脉选择大脑前动脉，流出静脉选择上矢状窦，通过去卷积运算获得脑组织时间－密度曲线(time－density curve，TDC)。通过后处理，获得反映肿瘤组织血流灌注状态的脑血流量(cerebral blood flow，CBF)、脑血容量(cerebral blood volume，CBV)、血管表面通透性(permeability surface area product，PS)和平均通过时间(mean transit time，MTT)伪彩色参数图像(彩图代表参数值:红色＞黄色＞绿色＞蓝色)，在上述功能图像上感兴趣区(region of interest，ROI)测量最大实质灌注区，平均每处ROI测量3次，取平均值，每个 ROI大小约30～50 pixels，测量时避开大血管。

1.4 病理学检查

1.4.1 大鼠脑组织获取:大鼠CT灌注检查后24 h内用10%水合氯醛麻醉处死，即刻剪开胸腔，暴露心脏，经左心室插入大号注射针头至升主动脉，接入生理盐水200 mL快速冲洗血管内血液有形成分，同时剪开右心房，以使血液流出;躯体变白后再灌注4%多聚甲醛固定脑组织，待四肢变硬后断头取脑，鼠脑再置入4%多聚甲醛溶液继续固定24 h，观察肿瘤大体形态学表现后用石蜡包埋，制成5 μm层厚的病理切片，HE染色，显微镜下进行组织病理学观察。

1.4.2 免疫组织化学检查:α－SMA相关抗原染色试剂盒购于武汉博士德公司。α－SMA一抗为小鼠抗大鼠抗体;二抗为抗小鼠兔通用型抗体。采用免疫组化链酶亲和素－生物素－过氧化物酶复合物(streptavidin－biotin－complex，SABC) 法作免疫组化染色。采用Weidner计数法:先在低倍镜 (40×)下找出高血管密度“热区”(hot spots)，再用高倍镜(200×)进行微血管计数。每个 α－SMA相关抗原染色阳性显示为一个独立棕褐色的血管腔。每个标本观察5个高倍视野，取平均值用于分析。

1.5 灌注参数统计学分析

采用SPSS11.5统计学分析软件，吸入高碳酸血症前后 CBV、CBF、PS、MTT比较分别进行配对 t检验;吸入高碳酸血症前后 CBV、CBF变化率与 α－SMA的相关性用Pearson相关分析;P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 正常大鼠吸入高浓度CO2混合气体前后血气分析

所有大鼠在吸入含10%CO2和90%空气的混合气体15 min后，动脉血CO2分压均明显升高 (t=9.39，P＜0.001)，血浆 pH 值降低 (t=13.49，P＜0.001)。动脉血氧分压以及血球压积无明显变化(P值均大于0.05)(表1)。

2.2 正常大鼠吸入高浓度CO2混合气体前后CT灌注参数的变化

正常SD大鼠右侧基底节区 CBV、CBF、PS值(均数±标准差)每 100 g组织分别为(10.28±4.01)mL、(304.95 ± 88.77)mL/min、(0.26 ±0.37)mL/min、MTT值为(1.48±0.07)s;吸入10%CO2和90%空气的混合气体后右侧基底节区CBV、CBF值明显增加，每100 g组织分别为(19.25±8.42)mL(t=4.92，P =0.001)和(507.33±167.94)mL/min(t=6.75，P ＜0.001)(表2，图1－a－d);吸入混合气体前后 CBV、CBF增加值每100 g组织各为(8.96±5.76)mL、(202.38±94.84)mL/min，CBV、CBF增加百分比分别为(87.14±46.45)%、(65.75±22.05)%;PS及MTT变化不显著(P 均＞0.05)(图 1－e－h)。大鼠右侧尾状核的CBV、CBF、PS和MTT与对侧比较无明显差异(P均＞0.05)(表3)。吸入高浓度 CO2混合气体后，右侧尾状核的CBV、CBF增加百分比分别为(88.16±35.14)%、(66.61±25.64)%;与左侧尾状核比较无明显差异(t值分别为0.55，0.99;P均＞0.05)。图1见封二。

表1 正常大鼠吸入高浓度CO2混合气体前后血气分析 (n=10，±s)Tab.1 Results of blood gas analysis in the normal rat brain pre－and post－hypercarbia(n=10，±s)

血气(Blood gas) 空气(Air) 10%二氧化碳(10%CO2) t值(t value) P值(P value)pH值(pH value)7.37±0.04 7.07±0.02 9.39 ＜0.001 CO2分压 (kPa)(PaCO2) 4.83±0.17 7.51±0.17 13.49 ＜0.001氧分压 (kPa)(PaO2) 14.26±0.62 13.99±0.53 0.92 ＞0.05血球压积(Hematocrit)35.32±1.47 34.60±1.55 1.45 ＞0.05

表2 正常大鼠右侧尾状核吸入高浓度CO2混合气体前后CT灌注参数 (n=10，±s)Tab.2 The CT perfusion values in normal rat right caudate nucleus area pre－and post－ hypercarbia(n=10，±s)

参数(Blood gas) 空气(Air) 10%二氧化碳(10%CO2) t值(t value) P值(P value)CBV值(mL/100 g)(CBV value)10.28±4.01 19.25±8.42 4.92 0.001 CBF值(mL/min.100 g)(CBF value) 304.95±88.77 507.33±167.94 6.75 ＜0.001 PS值(mL/min.100 g)(PS value) 0.26±0.37 0.73±0.65 1.83 0.101 MTT值(s)(MTT value)1.48±0.07 1.53±0.05 2.07 0.069

表3 正常大鼠左侧尾状核吸入高浓度CO2混合气体前后CT灌注参数(n=10，±s)Tab.3 The CT perfusion values in normal rat left caudate nucleus area pre－and post－hypercarbia(n=10，±s)

参数(Blood gas) 空气(Air) 10%二氧化碳(10%CO2) t值(t value) P值(P value)CBV值(mL/100 g)CBV value 10.26±3.59 18.93±7.60 5.65 ＜0.001 CBF值(mL/min.100 g)CBF value 292.12±77.50 485.60±135.60 8.42 ＜0.001 PS值(mL/min.100 g)PS value 0.44±0.43 0.32±0.33 0.76 0.47 MTT值(s)MTT value 1.49±0.05 1.50±0.03 1.14 0.27

2.3 正常大鼠吸入高浓度CO2混合气体前后CT灌注参数变化率与α-SMA计数之间相关性

α－SMA抗体免疫组化染色部位在血管的平滑肌细胞，呈现棕褐色散在分布于脑组织内，形态规则(图2)，α－SMA阳性染色血管计数为(12.7±3.23)条/高倍视野(×200)。Pearson相关分析显示，正常脑组织的CBV和CBF变化率与其α－SMA阳性计数之间呈显著相关 (r分别为0.652和0.890，P分别为0.041和0.001)。图2见封二。

3 讨论

脑血管反应性(cerebrovascular reactivity)是指脑血管在各种影响血管运动的因素的作用下能够舒张和收缩的能力。最初通过检测脑血管反应性可以评价脑血管的调节能力及侧支循环状态，对缺血性脑卒中的早期诊断、治疗以及预后评价均有重要意义。CO2是调节呼吸最重要的生理性体液因素，动脉血中一定水平的PaCO2是维持呼吸和呼吸中枢兴奋性所不可缺少的条件。当吸入气中CO2含量增加到2%时，呼吸加深;增至4%时，呼吸频率也增快，肺通气量可增加1倍以上。由于肺通气量的增加，肺泡气和动脉血 PaCO2可维持在接近正常水平。当吸入气中CO2含量超过7%时，肺通气量不能作相应增加，导致肺泡气、动脉血 PCO2明显增高，CO2堆积，CO2可以透过血脑屏障进入脑脊液，与H2O生成 H2CO3，由 H2CO3解离出的 H+对脑血管起舒张作用。

高碳酸血症可以通过高浓度CO2吸入法达到，高浓度 CO2气体来源方便，价格低廉，可以充分评价脑血管反应。广泛用于临床和试验研究［1，3，10－14］。临床上可以通过给予乙酰唑胺(acetazolamide，ACZ)和升高动脉CO2浓度来检测患者的脑血流储备。乙酰唑胺可以抑制碳酸酐酶，使CO2缓冲系统失衡，导致毛细血管前动脉扩张，从而增加脑血流量。静脉给予乙酰唑胺的剂量为15～18 mg/kg［15］后，由于脑血管的反应性，脑血流可以增加与吸入高浓度CO2一样有效，但其作用更稳定，而且没有吸入CO2的不良反应。但是，现在国内无ACZ针剂出售，必须从国外进口，而且价格较高，限制了ACZ的应用。本组实验应用10%CO2和90%空气混合气体吸入方法模拟高碳酸血症模型，吸入混合气体15 min后，血液pH值明显下降;PaCO2显著上升，前后对比有统计学意义，而 PaO2及血球压积无明显差异。因而建立了稳定的高碳酸血症模型。

目前，临床上已有多种影像学检查方法来测量脑血管反应性。经颅多普勒超声，通过测量吸入高浓度CO2或给予ACZ前后脑血管平均血流速率的变化，可以评价脑血管反应性，提供更多的高灌注恢复过程中的信息，缺点是不能检测脑血流本身，少数患者可能由于头骨过厚而使信号效果差甚至不能探测到血流。正电子发射计算机断层扫描(PET)，是当今最先进的核医学影像技术，运用脑血流灌注显像可以测量出屏息、吸入CO2或给予ACZ前后脑血流量的变化，评价脑血管反应性［2］，为测量脑血流量的“金标准”。尽管SPECT和PET在评价血流动力学状态方面具有极佳的优势，但其价格昂贵、成像时间长、图像空间分辨率差，有核放射性等缺点，限制了其临床应用［9，16］。MR 灌注成像，通过测定脑组织静息状态和激发实验中的差异，也能提供脑血流动力学信息，但MR灌注使用的EPI技术所产生顺磁性伪影致使颅底成像质量较差，受磁场不均一性影响大，成像时间较长，限制了MR灌注成像在血流储备研究中的应用。

CT灌注是近年来发展起来的新的测量组织器官血流状况的无创性技术［3，10］。CT灌注成像是指在静脉注射造影剂的同时，对选定的层面进行连续多次扫描后获得每一像素的TDC，利用TDC计算出像素的CBF、CBV、MTT和 PS值，据此产生多种相应的功能性脑灌注CT图像。

CT灌注成像的数学计算模型包括非去卷积模型(non－deconvolution)和去卷积模型(deconvolution)两类［17］:非去卷积模型应用 Fick原理，即组织器官中对比剂蓄积的速度等于动脉流入速度减去静脉流出速度，此方法要求较高的对比剂注射速率。去卷积数学模型概念复杂，主要反映的是注射对比剂后组织器官中存留的对比剂随时间的变化量，并不用对组织器官的血流动力学状况预先做一些人为的假设，而是根据实际情况综合考虑流入动脉和流出静脉进行数学处理，因此更真实反映组织器官的内部情况，注射流率要求较低。目前，CT灌注软件多采用去卷积模型来计算血流参数。本实验应用GE公司提供的ADW 4.2 Workstation中的脑 Perfusion 3.0协议灌注软件，计算 CBV、CBF、MTT血流灌注变化，并且，CT灌注可以测量PS值，对比剂经由毛细血管内皮进入细胞间隙的单向传递速率，评价毛细血管内皮细胞的完整性。本研究结果表明，吸入10%CO2混合气体后，脑组织 CBV、CBF均明显增加，每100 g组织CBV平均增加(8.96±5.76)mL/［(87.14±46.44)%］，每100 g组织 CBF平均增加(202.38±94.84)mL/min［(65.75±22.05)%］。CT 灌注成像可以评价脑血流储备［14，18，19］。研究显示CBV、CBF增加百分比与α－SMA染色血管数量明显相关，说明CT灌注参数CBV、CBF可以反映大鼠正常脑组织在高碳酸血症前后血流量及血容量的变化，并且CBV、CBF的变化率与成熟血管数量有关，从而为CT灌注成像研究脑胶质瘤血管成熟度提供基础。研究也显示PS值和MTT在高碳酸血症前后变化不显著。PS反映毛细血管通透性，正常脑组织成熟血管具有完整的血脑屏障，所以PS值理论上为0，所测得的PS值是灌注成像噪声存在的结果;在高碳酸血症状况下，脑血管血脑屏障仍保持完整，因而PS值无显著性变化。

(本文图1，2见封二。)

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Functional Response to Hypercarbia in Normal Rat Brain Studied by Perfusion CT

ZHANG Jia－wen，YAO Zhen－wei，LIU Han－qiu，YANG Yan－mei，LI Yuan，ZHANG Qing－bo，QING Shao－hua，FENG Xiao－yuan
(Department of Radiology，Huashan Hospital of Fudan University，Shanghai 200040，China)

ObjectiveTo investigate the changes of CT perfusion values in normal rat brain tissue at hypercarbia and analyze the correlation between perfusion CT and the results of α－SMA immunohistochemical analysis.MethodsA total of 10 male SD rats，weighting 250－300 g were used in this study.Perfusion CT was performed pre－ and post－inhalation(15 minutes delay)of a mixture of 10%CO2and 90%air.Perfusion CT values(CBV，CBF，PS and MTT)were meas－ured at the right nucleus caudatus in the rat brain.The rats were killed and their brains were removed within 24 hours after perfusion CT.Tissue samples of the nucleus caudatus in the rat brain were examined by histology using HE and immunohistochemical staining for α－SMA.Paired t test was used to determine the differences in perfusion CT values at the right nucleus caudatus in normal rat brain pre－ and post－hypercarbia.The differences in the changing rate(%)of CBV，CBF，PS and MTT between the right and the left caudate nucleus of rats inhaled 10%CO2mixture gas were determined using paried t test.Pearson correlation coefficients were used to assess the relationship between number of SMA positively stained vessels and changing rate(%)of CBV and CBF at right nucleus caudatus in the normal rat brain tissues.ResultsThe CBV，CBF，PS and MTT values(mean±SD)of normal rat right caudate nucleus area were(10.28±4.01)mL/100 g，(304.95±88.77)mL/min.100 g，(0.26±0.37)mL/min.100 g，and(1.48±0.07)s，respectively.After inhalation of a mixture of 10%CO2and 90%air，the CBV and CBF values of the right caudate nucleus area were significantly higher than those before hypercarbia(t=4.92，P=0.001 and t=6.75，P＜0.001).The increasing rates of CBV and CBF were(87.14±46.45)% and(65.75±22.05)%，respectively.However，no significant differences were detected for changes of PS and MTT after hypercarbia(P＞0.05 for both).The changs of CBV，CBF，PS and MTT of right caudate nucleus area were not significant compared with those of the contralateral brain tissues(P ＞0.05 for all).Immunohistochemical staining of normal SD rat brain tissues for SMA was all positively expressed in the smooth muscles of blood vessels，presenting as brown regular loops or tubes.The number for SMA positively stained vessels(mean ± SD)were 12.7 vessels per field±3.23.Significant correlations were observed between the number for SMA positively stained vessels and changing rates of CBV and CBF after hypercarbia in rat normal brain tissues(r=0.652 and r=0.89，respectively;P＜0.05 for both).ConclusionsPerfusion CT in the change in blood PaCO2can reflect the hemodynamic changes in normal rat brain tissues.These results demonstrate that changing rates of CBV and CBF correlate well with the number of mature vessels by means of changing blood PaCO2in normal rat brain tissues.

Rat;Tomography，X ray computed;Perfusion;Hypercarbia;α－SMA

R－81

1005－4847(2010)05－0361－06

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.05.001

2010－01－06

注：a. 吸入空气后正常大鼠脑CBV图；b. 吸入10% CO215min 后CBV图；c. 吸入空气后正常大鼠脑CBF图；d. 吸入10%CO215min 后CBF图；e. 吸入空气后正常大鼠脑PS 图；f. 吸入10% CO215min 后PS 图；g. 吸入空气后正常大鼠脑MTT图；h. 吸入10% CO215min 后MTT图。
图1 SD大鼠脑组织高碳酸血症前后CT灌注彩色图谱（灌注值：红色＞黄色＞绿色＞蓝色）
Note: a: CBV map after air inhalation; b: CBV map after inhalation of 10% CO2for 15 min; c: CBF map after air inhalation;d: CBF map after inhalation of 10% CO2for 15 min; e: PS map after air inhalation; f: PS map after inhalation of 10% CO2for 15 min; g: MTT map after air inhalation; h: MTT map after inhalation of 10% CO2for 15 min.
Fig.1 Normal rat brain CT perfusion maps (CTP values: red＞yellow＞green＞blue)