华南地区大豆根内拮抗菌AF-67筛选与鉴定*

区伟佳，王 荣，李敏清，袁英英，李华兴

（华南农业大学资源环境学院，广州 510642）

华南地区大豆根内拮抗菌AF-67筛选与鉴定*

区伟佳，王 荣，李敏清，袁英英，李华兴**

（华南农业大学资源环境学院，广州 510642）

筛选生防菌共436株，有生防性能71株，占16.3%，抑菌效果较好8株，占1.8%，能快速高命中率的获得具有防病效果好、抑菌谱广的生防菌株。内生菌AF-67与Fusarium oxysporum共培养时，能使其菌丝体及其分生孢子生长明显畸变。经16S rDNA基因序列分析，AF-67被初步鉴定为Bacillus amyloliquefaciens。

大豆根腐病；根内拮抗菌；筛选；鉴定；16S rDNA

大豆根腐病(Soybean root rot)在国内外大豆产区均有发生，是土传病害，危害较重[1]。该病对产量影响大，感病品种产量损失一般为5%～10%，严重的可达90%以上，甚至绝产。每年给国家造成巨额经济损失[2,3]。华南大豆产区高温多雨的气候环境，土壤紧实粘重、偏酸等均有利于根腐病的发生[4]，关于解决华南产区大豆根腐病的研究越来越受科研工作者的关注。

生物防治手段普遍应用于植物病害防治。许多根际或根内微生物同时具有防病、促生作用。土壤施用含有该生防菌株的生物肥料能减少农药的用量，降低成本，同时还能改善土壤条件及农产品品质[5]。在生防菌株的筛选源上，考虑生防菌在植株根部的定殖效果，着重研究从植株根际或根内中筛选。有研究表明，从根际或根内分离筛选出的拮抗菌能更好的定殖在植株根系[6,7]。

芽孢杆菌作为目标菌群，更能适合于生物肥料工业生产的要求。研究通过对有效生防菌的16S rDNA序列分析，确定生防菌的种类和来源。旨在提供一种快速、准确的生防菌选鉴方法。

1 材料与方法

1.1 细菌分离材料

采自华南农业大学博罗、宁西大豆试验田的大豆植株。

1.2 供试大豆根腐病原菌

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum） 3个高致病性菌株 F1、F2、F5；

丝核菌（Rhizoctoniasp）；

小核菌(Sclerotium rolfssii)；

以上供试菌种由华南农业大学资源环境学院根系中心分离与提供。

1.3 根内拮抗芽孢杆菌AF-67的分离

选取健康强壮大豆植株根系，表面消毒后，无菌状态置于灭菌研钵，加入适量LB培养基和灭菌石英砂，充分研磨后转入含50mL LB液体培养基中，150rpm富集培养30min。取出，置于80℃恒温水浴10min。培养液稀释后，取适当浓度涂布LB平板，36℃培养48h后挑取形态不同、长势较好的菌落，划线纯化。

1.4 拮抗菌筛选、抑菌效果与菌间相容性测定 [8,9]

距PDA平板中心3cm处互相垂直四个方向点接拮抗细菌，平板的中央接种经过活化的尖孢镰刀菌菌块(直径5mm)，28℃黑暗培养12d后记录菌圈直径，设5个重复。公式如下：

同时按上述的方法对丝核菌、小核菌进行拮抗性测定。

菌间相容性采用交叉划线法：取待检拮抗菌液依次两两交叉划线，在划线的交叉处出现透明不生长，为菌间不相容；无出现透明点，能正常生长为菌间相容[8，9]。

1.5 拮抗菌AF-67的鉴定

形态鉴定参照《伯杰氏鉴定细菌学手册》[10]；AF-67鉴定方法采用分子生物学16S rDNA序列分析：取培养至对数期菌液，用细菌DNA提取试剂盒提取AF-67的总DNA。配制扩增体系50uL，其中，正向引物K01(FC27):5’AGAGTTTGATCCTGGCTCA G 3’；反向引物K02(RC1492):5’TACGGCTACCTT GTTACGACTT 3’。PCR产物由北京奥科生物技术有限责任公司测序。序列结果通过BLASTN程序在GenBank核酸数据库中进行分析，确定其分类地位。

1.6 AF-67培养液对尖孢镰刀菌菌丝发育影响

将尖孢镰刀菌（F5） 菌块(直径5mm)与AF-67菌悬液3mL加入50mLKB培养液中，28℃，150rpm培养3d。吸取少量培养液，显微镜下观察真菌菌丝的生长情况。对照接病原菌块的KB培养液。

2 结果和讨论

2.1 大豆根内拮抗菌分离与筛选

从大豆根内筛选出候选生防菌共436株，其中具有生防性能71株，占16.3%，其中对大豆根腐病原菌具明显抑制作用8株，占1.8%，抑菌效果见表1。

试验证明该法能高命中率的获得具有防病效果好、抑菌谱广的生防菌株。由表1可知，所得菌株对峙试验后15d仍保持高抑菌效果性能。

表1 生防菌对大豆根腐病菌抑菌效果 %

2.2 生防菌相容性测定

生防菌间相容性测试结果显示（见表2），菌株AF8与其他大部分生防菌显示不相容性，其他菌株均显示可以共存。

表2 生防菌间相容性测试结果

2.3 拮抗菌AF-67的16S rDNA分子生物学鉴定

图1 拮抗菌AF-67的16S rDNA电泳条带及其测序峰图片段

优选有代表性，编号为AF-67拮抗细菌，16S rDNA序列比对结果经GenBank(NCBI)比对，登记号为lcl58891。根据同源性比较（见表3），与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp） 同源性最高，达99%，与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢杆菌 （Bacillus pumilus） 同源性也达97%。

表3 AF-67 16S rDNA在GenBank(NCBI)比对结果

拮抗菌16S rDNA的PCR扩增条带单一、清晰，位于约1.5kb处。其序列峰图效果理想，无出现错峰套峰，测序结果可靠性高（见图1）。

测序结果在GenBank核酸数据库中分析，构建系统发育树（见图2），分析遗传距离，其种间亲缘关系表明AF-67与B.Amyloliquefaciens的亲缘关系最近，且在同一个分支中，这再次验证了AF-67最可能为解淀粉芽孢杆菌。

2.4 AF-67对尖孢镰刀菌菌丝发育影响

拮抗菌AF-67与镰刀菌共培养后发现，能明显抑制病菌菌丝的生长（见图3）。菌丝体局部明显膨大、肿胀，菌丝不发育，同时有畸形、断裂现象，菌丝体分隔数显著增多。细胞内含物大量凝聚，部分形成大且透明的空泡。与对照相比，经共培养的镰刀菌产孢量明显减少。

图2 AF-67的系统发育树

图3 AF-67对尖孢镰刀菌菌丝发育影响

3 讨论

鉴于芽孢杆菌属的生物安全性、耐热特性和生产上的可操作性，试验能快速直接筛选出目标生防菌。结合分子生物学技术，对于难于培养、生化反应不明显及遗传表型等手段不能鉴定的细菌，采用此法提供快捷可行的解决方案。

造成大豆根腐的致病菌种类繁多杂乱，地域差异性大[11]。筛选的8株生防菌对几种华南地区的常见致病菌均显示较好抑菌效果。靶标菌中，国内以Fusarium oxysporum的出现频率最多[12，13]，大豆项目科研基地的感病植株，其5号高致病性菌株的分离率最高。筛选的AF-67对Fusarium oxysporum菌丝生长有一定的抑制作用，具开发利用潜力。

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［2］刘海龙,李春杰,许艳丽.生防细菌的抑菌谱和对大豆根腐病的防治［J］.大豆通报,2008,1:10-14.

［3］付春旭.大豆根腐病的发生及其综合防治策略［J］.大豆通报,2006,5:13-15.

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［13］苔莲梅.大豆根腐病菌（Fusarium oxysporum）毒素及其对大豆根部致病作用的研究［D］.哈尔滨：东北农业大学，2003.

In this study,the improved traditional screening methods could quickly obtain strains which showed antagonistic activity against soybean root rot and broad antagonistic spectrum.The activity of 436 strains assayed，16.3%of them showed antagonistic activity againstF.oxysporumf.sp.soybean and one of them,strain AF67 isolated from soybean roots was the best.Co-culture with Fusarium oxysporum,mycelium and conidia were evident distortion.Based on the sequence of 16S rDNA,strain AF67 was identified asBacillusamyloliquefaciens.

Soybean root rot;Antifungal Entophytic Bacteria;Isolation;Characterization;16S rDNA

S432.4+4

B

1674-3547(2010)02-0018-04

2009-12-22；修回日期：2010-01-12

国家自然科学基金项目（40971155）；广东省“十一五”攻关项目（2006B20301050），广东省教育部产学研结合项目（2009B090300330），广东省农业厅科技项目（粤农土肥（2004）28号）。

李华兴，男，教授，华南农业大学资源环境学院，E-mail:huaxli@scau.edu.cn