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生物保鲜乳酸菌的筛选及其细菌素特性研究

2010-09-18朱军莉励建荣

中国酿造 2010年5期
关键词:提液过氧化氢发酵液

朱军莉,王 晔,励建荣

(浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江省食品安全重点实验室,浙江杭州310035)

生物保鲜乳酸菌的筛选及其细菌素特性研究

朱军莉,王 晔,励建荣

(浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江省食品安全重点实验室,浙江杭州310035)

利用牛津杯法从传统泡菜和腊肠中分离的80株乳酸菌中筛选出10株具有较高抑菌活性的乳酸菌。通过排除酸性产物有机酸、过氧化氢干扰及抑菌谱试验,LAB5和LAB55仍表现广谱的抑菌活性;2菌株发酵上清液经蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶处理后抑菌活性均有降低,其中LAB5对木瓜蛋白酶敏感,因此可以初步判定这2株乳酸菌产生的抑菌物质为细菌素。2种细菌素具有良好的热稳定性,pH值越低抑菌能力越强;2株菌表现良好的产酸能力,经生理生化和16S rDNA鉴定为植物乳杆菌。

乳酸菌;细菌素;抑菌能力

随着食品化学防腐剂的高残留和对人体健康的潜在影响,具有无毒、安全等特点的生物保鲜剂日益受到人们的关注。生物保鲜物质直接来源于生物体自身组成成分或其代谢产物,能有效抑制蛋白酶的活性,防止蛋白质变性,具有良好的抑菌作用,从而可以达到保鲜的目的。目前,生物保鲜剂的种类繁多,但是实际应用于生产的并不多。

乳酸菌细菌素是细菌在代谢过程中由核糖体合成的蛋白类抑菌物质,不仅可以改善肠道生态,而且是一类具有潜在开发能力的天然食品防腐剂和饲料添加剂。其中,乳酸链球菌所产细菌素Nisin已被60多个国家广泛应用于乳制品和罐头制品等保藏。近年来,已有较多产抑菌物质的乳酸菌的报道[1-4],筛选广谱、高效的乳酸菌素产生菌及细菌素性质研究仍是研究热点[5-6]。本研究从泡菜和腊肠中筛选出具有生物保鲜价值的乳酸菌并进行鉴定,研究了乳酸菌的细菌素在不同条件下的抑菌效果,为其在食品生产中的应用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

培养基:液体MRS培养基:营养肉汤,2%水琼脂,1%营养琼脂。

试剂:过氧化氢酶、蛋白酶K购于上海生物工程公司;木瓜蛋白酶、胰蛋白酶购于诺维信有限公司,乳酸标准样品购于Sigma-Aldrich公司;16S rDNA的PCR扩增引物合成和测序列于上海生工生物工程技术服务有限公司;其他试剂均为分析纯:购自华东医药股份有限公司。

仪器:Biofuge Stratos台式高速冷冻离心机,Aglient 1100高效液相色谱仪,恒温培养箱,酶标仪,水平电泳装置,凝胶成像系统。

1.2 细菌的活化

取1mL乳酸菌菌种到MRS液体培养基中,37℃培养24h,置于4℃冰箱保存备用。指示菌藤黄微球菌、柠檬色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌在营养琼脂上划线,荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌,37℃培养12h,挑取单菌落到液体培养基,37℃培养12h,置于4℃冰箱保存备用。

1.3 乳酸菌代谢产物抑菌效果分析方法

采用双层琼脂牛津杯法。将2%水琼脂倒在固体平板上,待冷却凝固后,向琼脂内倒入含5%指示菌营养琼脂,摇匀。待凝固后放入牛津杯,用移液枪向牛津杯内加入200μL乳酸菌代谢产物的上清液,37℃培养24h后观察有无抑菌圈形成,并测量其抑菌直径。

1.4 产抑菌物质乳酸菌的复筛

初筛所得的菌株发酵上清液中加入过氧化氢酶,使最终浓度为0.5mg/mL,37℃水浴2h后检验抑菌活性,以排除过氧化氢的干扰。同时以pH值为4.8的乳酸和乙酸为对照,进行抑菌试验分析,以排除有机酸的干扰。

1.5 抑菌物质粗提液性质的研究

1.5.1 蛋白酶敏感性试验

将乳酸菌粗提液pH值调至7.0,依次添加蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶,使最终浓度分别为0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.2mg/mL,37℃水浴2h后,调pH值与粗提液相同,分析抑菌活性。

1.5.2 抑菌物质热稳定性的试验

将乳酸菌粗提液分别于37℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴30min,分析其抑菌活性。

1.5.3 pH值耐受性试验

将乳酸菌粗提液以1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠分别调pH值为3、4、5、6、7、8,分析其抑菌活性。

1.6 菌株生长曲线和产酸特性测定

将乳酸菌菌株按2%(v/v)的接种量接种于15mL MRS液体培养基,37℃培养,每隔2h采用比浊法于波长600nm处测定细菌细胞生长量的吸光度值,并测定pH值。以培养时间为横坐标,对应的吸光度值、pH值为纵坐标绘制生长曲线和产酸特性图。

1.7 乳酸含量的测定

采用Agilent A1100高效液相色谱(HPLC)仪,色谱柱为Agilent ZORBAX 80A Extend-C18,4.6×150mm,3.5μm.柱温40℃,流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾溶液(pH2.3),流速为0.5mL/min,检测波长为210nm。根据乳酸标准品、发酵液、未接种的发酵液的保留时间定性,外标法定量[7]。

1.8 乳酸菌的鉴定

1.8.1 生理生化鉴定

观察平板上的菌落形态、革兰色染色,及选择乳酸菌微量生化鉴定管反应,参照《常用细菌系统鉴定手册》中相应的指标比对鉴定。

1.8.2 16S rRNA 鉴定

细菌基因组DNA的抽提,参考MARMUR J等[8]的方法提取。以抽提的LAB5、LAB55细菌DNA组作为PCR扩增的模板,用于16SrRNAPCR扩增的引物为1对通用引物。PCR产物电泳分析及纯化后测序。测序得到的序列通过BLAST程序在GenBank基因库进行同源性比较。

2 结果与讨论

2.1 产抑菌物质乳酸菌的初步筛选

取出从泡菜和腊肠中分离的80株乳酸菌(其中LAB1~LAB45株提取自泡菜,LAB46~LAB80提取自腊肠)。通过牛津杯法初步筛选获得10株乳酸菌具有对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌表现良好的抑制作用,分别为LAB5、LAB11、LAB12、LAB25、LAB26、LAB32、LAB38、LAB43、LAB45和LAB55。

图1 产抑菌物质乳酸菌初筛Figure 1.Preliminarily screening of LAB with high anti-bacterial activity

2.2 产抑菌物质乳酸菌的复筛

乳酸菌对指示菌的抑菌作用,可能是酸性产物如乙酸、乳酸及其他有机酸的作用。为了排除酸性末端产物的干扰,将培养过夜的10株乳酸菌培养液离心,得到上清发酵液。上清发酵液的pH值均在4.5左右,分别以pH值为4.5的乳酸和乙酸为对照,进行抑菌试验分析。同时,利用过氧化氢酶可以降解过氧化氢的特性来排除过氧化氢的干扰,结果见表1。与发酵液相同pH值的乳酸和乙酸对金黄色葡萄球菌没有抑制作用,而发酵液有明显的抑菌活性。经过过氧化氢酶处理的发酵液与原发酵液相比,LAB12和LAB45上清液的抑菌活性下降明显,而其他发酵液抑菌活性降低不显著。因此,8种乳酸菌所产生的抑菌活性物质不是酸性产物,也不是过氧化氢。

表1 过氧化氢酶处理和有机酸对上清液抑菌效果的影响Table 1.Effect of treatment with catalase and organic acid on the anti-bacterial activity of supernatants mm

2.3 抑菌谱分析

8株菌株对产生的抑菌物质的抑菌谱见表2。经过抑菌谱分析,发现8株菌对供试菌株表现一定的抑菌效果,其中LAB5和LAB55对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌具有较强抑菌活性,表明具有较广谱的抑菌谱,其中LAB55对芽孢杆菌也具有良好的抑菌作用。因此,后续试验中选取LAB5和LAB55进行抑菌物质性质和菌株鉴定研究。

表2 乳酸菌对致病菌的抑菌谱Table 2.Anti-bacterial spectrum of LAB mm

2.4 抑菌物质粗提液的性质

2.4.1 蛋白酶的敏感性

研究通常以抑菌物质是否被蛋白酶降解作为区分细菌素与类细菌素的标准,抑菌物质粗提液分别经蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶处理后,检测其抑菌活性,结果(表3)可见,经上述3种酶的处理,LAB5和LAB55粗提液抑菌活性均下降,其中对胰蛋白酶的敏感性最高,抑菌活性降低了50%,其次为蛋白酶K,而木瓜蛋白酶处理相对较小。

表3 蛋白酶处理对上清液抑菌活性的影响Table 3.Effect of treatment with proteases on the anti-bacterial activity of supernatants mm

2.4.2 抑菌物质的热稳定性

LAB5和LAB55上清液经不同高温处理30min后,以未加热处理为对照,结果(表4)可见,高温对抑菌物质活性几乎无影响,2株菌的提取液在100℃处理30min后,仍表现良好的抑菌活性。李南薇等[9]研究燕糖酸奶中分离的乳酸菌100℃处理30min后仍保留强的抑菌活性,敖灵等[10]报道肉源性乳酸菌分泌的产广谱细菌素表现较好的热稳定性。

表4 热处理对上清液抑菌活性的影响Table 4.Effect of heating on the anti-bacterial activity of supernatants mm

2.4.3 抑菌物质的耐酸特性

以1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠将粗提液分别调pH值为3、4、5、6、7、8,检验其抑菌活性见表5。2株菌上清提取物的抑菌物质受pH值影响较大,pH值<4的酸性条件下pH值越低抑菌效果越强,而pH值>4的抑菌活性显著降低,pH值>5后几乎失去了抑菌活性,表明2个菌株分泌的细菌素对酸敏感。

表5 pH值对上清液抑菌活性的影响Table 5.Effect of pH on the anti-bacterial activity of supernamtamnts

2.5 产抑菌物质乳酸菌生长曲线和产酸特性

LAB5和LAB55菌株的生长曲线和对应时间培养液中的pH值变化见图2。LAB5菌株在6h开始进入对数生长期,在18h进入生长稳定期。而LAB55在6h进入对数生长期,14h进入稳定期。2株菌的产酸速率和菌体的生长速度成正相关趋势,在进入稳定期后,溶液中的pH值也趋向于平稳。LAB55产酸能力较强于LAB5菌株,最低pH值分别为3.90和4.11。

2.6 菌株乳酸发酵特性

用高效液相色谱(HPLC)对菌株发酵液中的乳酸含量进行定量测定结果见图3。接种LAB5和LAB55发酵液中乳酸含量明显增加,通过和乳酸的标准液对照,LAB5、LAB55的乳酸产量分别达到50g/L和55g/L。

2.7 乳酸菌的鉴定

2.7.1 生理生化结果

表6 LAB5和LAB55生理生化鉴定结果Table 6.Physiological and biochemical test results of LAB5 and LAB55

将2株乳酸菌分别进行革兰氏染色和生化鉴定,结果见表6。将结果和《常用细菌系统鉴定手册》中植物乳杆菌的碳水化合物反应特征对照,17个指标中,LAB5只有纤维二糖、松三糖、棉籽糖、山梨醇、木糖不符,LAB55只有纤维二塘、半乳糖、棉籽糖、山梨醇不符,并且这种不符可能和具体评价标准有关,因此初步认为2个菌株均为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

2.7.2 菌株的16S rRNA结果

以通用引物进行PCR扩增,获得了2条特异的、大小约为1.5kb的扩增条带。获得的特异片段经纯化和测序后,通过Blast程序与GenBank核酸序列库中的序列进行比对,发现LAB5和LAB55与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的相似性都超过99%。结合生理生化的鉴定结果,LAB5和LAB55鉴定为植物乳杆菌。

3 结论

从传统泡菜和腊肠中分离的80株乳酸菌中筛选出2株具有较高抑菌活性的乳酸菌LAB5和LAB55,所产生的抑菌物质可以有效抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长,可被多种蛋白酶失活,对热稳定、pH值越低抑菌能力越强,该类抑菌物质是一种蛋白质活性的细菌素物质。2株乳酸菌具有良好的产酸能力,鉴定为植物乳杆菌。

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[7]汪晓辉,于平,励建荣.泡菜、传统腊肠中降胆固醇乳酸菌的筛选及鉴定[J].微生物学报,2009(11):1438-1444.

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Screening of biological preservative lactic acid bacteria and characterization of the bacteriocin

ZHU Junli,WANG Ye,LI Jianrong
(College of Food Science and Biotechnology Engineering,Zhejiang Gongshang University,Key Laboratory of Food Safety of Zhejiang Province,Hangzhou 310035,China)

Ten strains lactic acid bacteria(LAB)with high anti-bacterial activity were isolated from 80 LAB strains from traditional fermented pickles and sausage by the method of Oxford cup.After eliminated the disturbances of organic acids,H2O2and analysis of anti-bacterial spectrum,LAB 5 and LAB 55 still exhibited broad-spectrum effects on bacteriostasis.Antimicrobiostatic activity of two fermentation supernatants were both decreased after treated with protease K,trypsin and papain.In addition,LAB 55 is sensitive to papain.Therefore,it was preliminary suggested that the bacteriostats should be protein bacteriocin.The two bacteriocins had good thermal stability,higher anti-bacterial activity with lower pH value.Two strains of LAB5 and LAB 55,with strong ability of acid production,were identified asLactobacillus plantarumby the physiological and biochemical characteristics and 16 SrDNA sequence.

lactic acid bacterium;bacteriocin;anti-bacterial activity

TS201.3

:A文献标志码:0254-5071(2010)05-0042-04

2010-01-15

国家863项目课题(2007AA091806)

朱军莉(1979-),女,浙江武义人,博士研究生,研究方向微生物学。

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