三痹汤对实验性关节炎大鼠关节滑膜MMP-3及明胶酶-B的影响

张春芳，客蕊，汪洋，王岩，郭玉红

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性进行性的自身免疫性疾病。以关节滑膜炎及对称性、破坏性的关节病变为主要特征。其病因及发病机制仍不清楚，但细胞因子已被公认是RA炎症和关节损伤的重要介质，其主要的病理环节涉及免疫功能失常、关节滑膜细胞聚积与滑膜增厚、关节软骨和骨破坏三个方面。本课题前期研究结果表明，三痹汤能降低佐剂型关节炎(AA)大鼠血清中TNF-α及IL-1表达水平，对关节炎症进展有一定的抑制作用。本实验进一步观察三痹汤对AA大鼠膝关节及滑膜组织内的病理变化及关节滑膜组织内MMP-3、明胶酶-B表达的影响，结合前期研究结果，阐明三痹汤对AA大鼠膝关节及滑膜组织内类风湿因子的调控机制，以期为临床三痹汤防治RA提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠60只，6～8周龄，体重(180±20)g，均购自于由黑龙江中医药大学实验动物中心，在通风、温度及湿度适宜的动物室内常规饲养。

1.1.2 药品与试剂 川续断、杜仲、防风、华阴细辛等16味中药材均购自于黑龙江省药材公司;雷公藤多苷片(上海医科大学红旗制药厂，批号:20070602，10mg/片);注射用卡介苗(上海生物制品研究所，批号20061103，75mg/支);MMP-3、明胶酶-B 试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3 实验仪器与设备

YS100光学显微镜(日本OLYMPUS公司);展片仪、烤片机(中国天津爱华公司);RM2135超薄切片机德国(LEICA VLTRACUT公司);CMIA系列-多功能真彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学图像中心);MK2500型足容积测量仪(日本Mukomachi Kiai CD公司)。

1.2 方法

1.2.1 药物的制备

三痹汤混悬液制备:川续断、杜仲、防风、华阴细辛等16味中药材3倍量的水浸泡1h后，加热煎煮2次，第1次煎3h，第2次煎2h，2次煎煮液混合后，80℃水浴浓缩成膏，60℃干燥箱中烘干成粉末，每克粉末含生药3.52g。将中药粉末加蒸馏水定期配制成混悬液，浓度为20%。

雷公藤混悬液:将雷公藤多苷片研成细末，加生理盐水，配制成混悬液(每ml含雷公藤多苷1mg)。

弗氏完全佐剂(FCA):取冻干卡介苗50mg 80℃、1h灭活后，混入高压灭菌的液体石蜡、羊毛脂(1∶1)12.5mL，配成10g·L-1的乳剂，充分碾磨、混匀即得。

1.2.2 模型制备与分组

将60只大鼠随机分为5组:空白对照组、模型对照组、三痹汤高剂量组、三痹汤中剂量组、雷公藤(TPT)对照组，每组12只。大鼠佐剂性关节炎(AA)的模型制备:临用前从冰箱取出弗氏完全佐剂，充分振荡、混匀。大鼠常规消毒后将其右后肢拉直，用1mL注射器针头于足拓中部皮内注射，每只大鼠注射0.1mL弗氏完全佐剂。除空白对照组外，其余四组均制备AA模型，所有动物均造模成功［1］。

1.2.3 给药方法

按人、大鼠给药剂量体表面积折算公式计算出给药计量。造模后第8天灌胃给药，三痹汤高剂量组灌服中药混悬液3.46g·(kg·d)-1，三痹汤中剂量组灌服中药混悬液1.73g·(kg·d)-1，雷公藤组灌服雷公藤混悬液9.45mg·(kg·d)-1，模型组和空白组灌服同体积的蒸馏水。连续给药21d。

1.2.4 足跖肿胀度的计算

分别于致炎前、给药前、末次给药后1h用足容积测量仪测量各组大鼠、左、右后足容积。

1.2.5 光镜观察关节病理变化

造模21天后处死大鼠，取双侧踝关节，4%多聚甲醛固定1周，10%EDTA脱钙1周，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，HE常规染色。于光学显微镜下观察病理形态学改变。

1.2.6 免疫组化检测关节滑膜MMP-3、明胶酶-B的表达

①石蜡切片脱蜡至水化，3%H2O2室温孵育5min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次，热修复抗原后PBS(0.01md·L-1pH 7.4)洗2次，每次5min;②10%的正常山羊血清封闭，室温下孵育10min，PBS冲洗5min;③加1∶200稀释的一抗，37℃孵育1～2h，PBS冲洗3次，每次5min;④滴加生物素标记的二抗，室温下孵育10min，PBS冲洗3次，每次5min;⑤滴加碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育60min;PBS冲洗3次，每次5min;⑥DAB染色，苏木素复染，脱水、透明、封片，显微镜下观察。

图像分析:随机选取5个高倍视野(×200)，计算每个视野的阳性面积比，取其平均值。阳性面积比为每个视野阳性目标面积占整个统计面积的百分率。

1.2.8 统计学处理

2 结果

2.1 光镜观察关节病理变化

空白组大鼠可见滑膜组织无增生及炎性细胞浸润，无血管翳形成，骨及软骨结构基本正常。模型组大鼠可见滑膜组织增生，细胞明显充血水肿、呈不规则排列，大量炎细胞浸润，关节软骨表面粗糙，骨部分破坏，血管翳形成并部分伸向关节腔，关节腔隙明显缩小。雷公藤多甙组可见大鼠少量滑膜组织增生，细胞充血不明显，排列较规则，散见炎细胞浸润，关节软骨面较完整，局部粗糙，血管翳形成，关节腔隙稍缩小。三痹汤高剂量组由2～3层滑膜细胞构成，细胞排列较整齐，仍可见少量炎细胞浸润，关节软骨及骨变化与雷公藤多甙组相当。三痹汤中剂量组可见滑膜组织轻度增生，部分细胞排列尚规整，踝关节和滑膜组织中炎性细胞明显减少，关节软骨破坏程度降低，关节腔隙轻度缩小，改善程度劣于高剂量组。

2.2 三痹汤对AA大鼠足跖肿胀度的影响

表1结果显示，致炎后给药前，与空白对照组相比，模型对照组、三痹汤高、中剂量组、TPT组大鼠左、右后足跖肿胀度明显增高，有统计学意义(P＜0.05);与本组给药前相比，三痹汤高、中剂量组左、右后足跖肿胀度及TPT组右后足跖肿胀度明显减轻，有统计学意义(P＜0.05)。与给药后模型对照组比较，三痹汤高、中剂量组及TPT组大鼠左、右足跖肿胀度明显减轻，有统计学意义(P＜0.05)，与TPT组相比，三痹汤组高、中剂量组左、右足跖肿胀度无明显变化，无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组对AA大鼠足趾肿胀度影响的比较(±s)

表1 各组对AA大鼠足趾肿胀度影响的比较(±s)

注:与本组给药前比较，△P＜0.05;与模型对照组给药后比较，*P＜0.05;与空白对照组比较，#P＜0.05。

组别n 左后足跖肿胀度 右后足跖肿胀度给药前(%) 给药后(%) 给药前(%) 给药后(%)空白对照组15 2.31±0.13 2.53±0.21 2.42 ±0.18 2.75 ±0.19模型对照组 15 7.55±1.07# 8.47±1.15 31.91 ±4.90# 28.59±3.71三痹汤高组 15 7.46±2.00# 6.77±1.90△* 31.78 ±6.10# 18.57±4.26△*三痹汤中组 15 7.61±1.13# 6.82±1.01△* 32.65±5.03# 19.66±3.28△*TPT组 15 7.50±1.60# 6.50±0.97* 31.86 ±5.70# 17.05±3.50△*

2.3 三痹汤对AA大鼠关节滑膜MMP-3的表达的影响 见表2。

表2 各组对AA大鼠滑膜组织MMP-3影响的比较(±s)

表2 各组对AA大鼠滑膜组织MMP-3影响的比较(±s)

注:空白组比较，★P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05;与TPT组比较，*P ＜0.05，#P ＞0.05。

组别 n MMP-3阳性面积比空白对照组15 7.72±0.78模型对照组 15 14.74±3.08★三痹汤高组 15 10.77 ±2.11△#三痹汤中组 15 11.82 ±1.87△*TPT组 15 9.50 ±1.97△

由表2可见，与空白对照组比较，模型组大鼠滑膜组织中MMP-3呈强阳性表达，具有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较，三痹汤各组、TPT组能下调AA大鼠滑膜组织MMP-3的表达，具有统计学意义(P＜0.05);与TPT组比较，三痹汤高剂量组下调AA大鼠滑膜组织MMP-3的表达程度相当，无统计学意义(P＞0.05)，三痹汤低剂量组下调的程度减低，有统计学意义(P＜0.05);提示三痹汤高、中剂量组均能降低AA鼠滑膜组织中MMP-3的表达，其中高剂量组作用较强。

2.4 三痹汤对AA大鼠关节明胶酶-B的表达的影响 见表3。

表3 各组对AA大鼠滑膜组织明胶酶-B影响的比较(±s)

表3 各组对AA大鼠滑膜组织明胶酶-B影响的比较(±s)

注:与空白组比较，★P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05;与TPT组比较，*P ＜0.05，#P ＞0.05。

组别 n MMP-3阳性面积比空白对照组15 17.36±3.76模型对照组 15 59.70±6.53★三痹汤高组 15 27.73 ±4.53△#三痹汤中组 15 33.92 ±5.36△*TPT组 15 23.50 ±3.97△

3 讨论

类风湿性关节炎(RA)是一种以关节滑膜炎症为主要病理表现的慢性、系统性的自身免疫性关节炎疾病。其重要的病理变化为滑膜组织过度增生、关节软骨和骨组织进行性破坏及功能障碍。近年研究发现，基质金属蛋白酶(MMPs)的异常表达，可以直接降解软骨和骨质，引起关节软骨及骨的损伤，从而对关节造成破坏，参与了 RA 的发病［2，3］。MMP-3 被认为是导致软骨降解的最重要的蛋白酶［4］。许多信息激活MMP-3后才能活化其它MMPs，是RA关节损伤的主要介质，通过降解Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等，引起骨组织的破坏［5，6］。RA患者关节滑液及滑膜组织均有明胶酶-B的高表达，认为明胶酶-B可能是反映关节局部炎症的标志物，通过降解明胶及存在于软骨中的其他胶原质(如Ⅰ型胶原等)，参与关节软骨破坏及RA进展过程［7，8］。RA关节软骨的破坏是胶原酶、基质降解酶和明胶酶共同作用的结果［8］

佐剂性关节炎大鼠(AA)是一种目前公认的研究RA经典动物模型。被广泛运用于研究RA的发病机理和新药疗效。本研究采用AA大鼠模型，观察三痹汤对大鼠AA模型作用机制的影响。结果显示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠左、右后足跖肿胀度明显增高，滑膜组织增生，呈不规则排列，大量炎细胞侵润，提示模型制备成功;三痹汤中、高剂量及TPT均能明显抑制AA大鼠继发性、自身免疫性炎症性足肿胀，(P＜0.05)关节可见少量滑膜组织增生，排列较规则，散见炎细胞浸润，关节软骨面较完整，并下调AA大鼠大鼠滑膜组织MMP-3和明胶酶-B表达水平，与TPT组比较，三痹汤高剂量组疗效相当，三痹汤中剂量组量低效逊，至于三痹汤中、高剂量是否有无明确的量效关系有待于进一步研究。

RA属于中医学痹证范畴，“痹者，闭也，三气杂至，壅闭经络，血气不行，不能随时祛散，故久而为痹。”三痹汤出自于《妇人大全良方》，具有补气和血、袪风除湿、散寒止痛、益肾滋阴功效，主治由风、寒、湿三气杂至而成之痹症。方中四物汤补血活血，四君子汤祛邪先扶正，正气旺则邪气不可干;独活、秦艽、防风驱风湿，止痹痛;杜仲、续断、牛膝壮筋骨，补肝肾;白花蛇，穿山甲、䗪虫活血通络。三痹汤诸药合用，散药得补药以行其势，辅正驱邪，通过抑制炎性细胞因子IL-1和TNF-a过度释放，阻断其诱导下MMP-3、明胶酶-B高水平表达，改善滑膜细胞增生引起基质降解程度，进而减轻或延缓关节损伤［9］，使其恢复阴阳平衡状态，既能显著抑制免疫性炎症又能“扶助正气”，为临床上应用三痹汤治疗RA提供了实验依据。与Clio等认为MMP-3可以作为RA患者滑膜损害的指标并可预测疾病的预后结果一致。

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