齐墩果醇-龙胆三糖苷雌激素样作用及其对肝癌 HepG2细胞增殖的影响

杨笛笑,李麒麟,张国林,王 飞

中国科学院成都生物研究所,成都 610041

齐墩果醇-龙胆三糖苷雌激素样作用及其对肝癌 HepG2细胞增殖的影响

杨笛笑,李麒麟,张国林,王 飞＊

中国科学院成都生物研究所,成都 610041

肝癌目前已经成为世界第三大癌症,临床数据显示雌激素及其受体与肝癌关系密切。苯并呋喃类化合物有报道具有雌激素样作用。所以,作为苯并呋喃的一种,研究齐墩果醇-龙胆三糖苷雌激素样作用及其对HepG2细胞增殖的影响显得尤为重要。在瞬时转染有 ERE(雌激素作用元件)报告基因的 HepG2中,齐墩果醇-龙胆三糖苷显示了同 17β-雌二醇一样激活 ERE报告基因的作用;而在瞬时转染有 CRE(cAMP作用元件)报告基因的 HepG2中,齐墩果醇-龙胆三糖苷也显示了升高 cAMP浓度的作用,进一步提示齐墩果醇-龙胆三糖苷的类雌激素样作用。齐墩果醇-龙胆三糖苷对 HepG2细胞增殖实验显示,30μmol/L浓度时该化合物的雌激素样作用同 17β-雌二醇一样有相似的促 HepG2细胞增殖作用。

齐墩果醇-龙胆三糖苷;雌激素样作用;HepG2细胞;ERE;CRE

现在肝癌已经成为世界第三大癌症,临床数据显示雌激素及其受体与肝癌关系密切,大量资料证实外源性的雌激素长期刺激可导致肝细胞肿瘤发病率的升高[1,2]。虽然雌激素对肝癌影响的准确机制至今仍无定论,但是普遍观点认为雌激素通过其经典信号途径与核雌激素受体结合,促进肝细胞的基因发生非整合性改变从而导致肝癌[3]并且促进肝癌细胞增殖。第二信使 cAMP是细胞内的信息分子,在细胞活化、增殖及凋亡过程中有十分重要的作用。雌激素能通过非经典途径,与细胞膜的雌激素受体或内质网膜的 GPR30结合后增加 cAMP的浓度,是雌激素非经典信号激活的一个重要标志[4]。

实验室前期研究 (专利申请号:200510020477. 7)发现,瓦山安息香种植物 (Styrax perkinsiae,Rehd)果实中的乙醇提取物具有促雌激素生成作用[5]。其主要成分 2-芳基苯并呋喃类化合物常见活性报道为体外抗菌及一定程度的细胞毒性[6-9],目前也有报道其作为选择性雌激素受体调节剂有雌激素样作用[10,11]。齐墩果醇-龙胆三糖苷作为从瓦山安息香果实中的乙醇提取物中分离出来的一种 2-芳基苯并呋喃类化合物,相对报道较少。因此,评价齐墩果醇-龙胆三糖苷类雌激素作用及其对肝癌细胞的增殖影响,对后续研究齐墩果醇-龙胆三糖苷类雌激素作用机制显得尤为重要。

本试验从齐墩果醇-龙胆三糖苷是否有类雌激素作用着手,讨论该化合物对肝癌细胞 HepG2增殖的影响,并说明类雌激素作用与 HepG2增殖的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

齐墩果醇-龙胆三糖苷为实验室前期研究中从瓦山安息香 (Styrax perkinsiaeRehd)种子氯仿和正丁醇相中分离得到的单体[12]。

HepG2肝癌细胞株购自 ATCC,pERE/Luc (Stratagene,Inc);SunBioTMAm-Blue细胞增殖与活性检测试剂 (上海生博医学生物工程科技有限公司 );Lipofectamine2000转化试剂盒 (Invitrogen, Inc);17β-雌二醇 (Sigma,Inc);荧光素酶检测试剂盒(Promega,Inc)。

1.2 仪器

CO2培养箱 (Ther mo,Inc);化学发光检测仪(Thermo,Inc);离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);恒温摇床 (上海智城分析仪器制造有限公司);无菌操作台(苏州净化设备有限公司);微量移液器(Gilson,Inc)

1.3 细胞培养

HepG2细胞常规培养于 RPM I1640(10%小牛血清,100 U/L青霉素、100 mg/L链霉素液)培养基中,37℃,5%CO2条件下 CO2培养箱培养。

1.4 HepG2细胞的转染

按 2.5×105个/mL密度接种 HepG2细胞于 24孔板中,10%去内源性激素血清的 RPM I1640培养基,无抗生素培养 24 h使细胞汇合度达到 85%。

以DNA(μg)∶Lipofectamine(μL)=1∶2.5的比例,即 pERE– Luc质粒按每孔 0.7μg pERE-Luc +0.1μg pSV-βgal比例加入 50μL OPTI-MEM培养基混匀;pCRE– Luc质粒按每孔 0.7μg pCRELuc+0.1μg pSV-βgal比例加入 50μL OPTI-MEM培养基混匀。2μL lipofectamine加入 50μL OPTIMEM培养基混匀,静置 5 min,将质粒溶液逐滴加入到 lipofectamine溶液中,静置 0.5 h,待其形成复合物。按每孔 100μL复合物的量加入复合物至每孔400μL去内源性激素血清的常规 RPM I1640培养基中转染 4～6 h。

1.5 齐墩果酸-龙胆三糖苷对肝癌细胞 HepG2内雌激素作用元件的影响

转染有pERE–Luc质粒的HepG2细胞转染后换去原有培养基,分为三组进行试验:空白对照组、阳性对照组 17β-雌二醇终浓度 10 nmol/L、样品组齐墩果醇-龙胆三糖苷终浓度 30μmol/L。继续在 37℃,5%CO2条件下培养 24 h。

1.6 齐墩果酸-龙胆三糖苷对肝癌细胞 HepG2内cAMP的影响

转染有pCRE–Luc质粒的HepG2细胞转染后换去原有培养基,分为三组进行试验:空白对照组、阳性对照组 forskolin 10 nmol/L、样品组齐墩果醇-龙胆三糖苷终浓度30μmol/L。继续在37℃,5%CO2条件下培养 24 h。

1.7 荧光素酶检测

按照 1.5和 1.6步骤加药 24 h后,取细胞裂解液 50μL根据荧光素酶检测试剂盒 (steady-glo luciferase assay system.Promega)说明书操作,吸取各样品细胞裂解上清 50与 50μL luciferase assay reagent在化学发光检测仪上定量检测荧光素酶活性(RLU值)。

为排除由于转染效率不同造成的报告基因RLU值差异,故在转染时共转内参对照pSV-βgal,检测βgal半乳糖苷酶活性从而将 RLU值平均到同一转染水平。βgal半乳糖苷酶活性检测:60μL裂解液,133μL ONPG,6μL Mg2+,400μL PBS,混合后37℃水浴至黄色出现。420 nm检测 OD420。所有实验至少重复 3次每组设置三复孔,所得结果以 x ±s表示。采用 t检验对数据进行统计学分析。

1.8 齐墩果酸-龙胆三糖苷对肝癌细胞 HepG2增殖的影响

取对数生长期 HepG2细胞,按 1×105个/mL密度接种 100μL在 96孔培养板中,去内源性激素血清的 RPM I164无双抗培养基培养 24 h。待细胞生长为单层后分别加入 17β-雌二醇和 Egonol龙胆三糖苷。以不加药物作为空白对照,加入 17β-雌二醇终浓度 10 nmol/L作为阳性对照,齐墩果醇-龙胆三糖苷浓度梯度为 300、30、3、0.3、0.03μmol/L,继续在 37℃,5%CO2条件下培养 72 h。

在待测细胞上清中加入 10%细胞悬液体积的检测试剂,在细胞培养箱内孵育 2～6 h,培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色后即可进行检测。

用全波长酶标仪测定吸光度,滤波器波长 570nm,参考波长 600 nm,(实际吸光读数 =OD570-OD600)。重复三次试验,细胞的增殖率按下面公式计算:增殖率(%)=[(用药组 OD值 -空白对照组OD值)/空白对照组OD值]×100%。

2 结果与分析

2.1 齐墩果醇-龙胆三糖苷对肝癌细胞 HepG2内雌激素作用元件的影响

图 1为齐墩果醇-龙胆三糖苷对 HepG2细胞胞内 ERE的影响。为排除因转染效率引起的 RLU值变化,将 pERE-Luc与 pSV-βgal一起共转后,检测βgal半乳糖苷酶活性,从而将 RLU值平均到同一转染水平。

图1 齐墩果醇-龙胆三糖苷对人HepG2细胞中 ERE的影响Fig.1 Effect of Egonol gentiotrioside on ERE in HepG2 of human

从图 1可以看出,以空白组 RLU值为 1时,阳性组相比于空白组对照组 RLU值为 3左右,差异极其显著 (P＜0.01)。化合物齐墩果醇-龙胆三糖苷组相较于空白对照组相对 RLU值与阳性组几乎相同,差异极其显著 (P＜0.01)。表明齐墩果醇-龙胆三糖苷与 17β-雌二醇一样有作用于雌激素作用元件的作用。

图2 齐墩果醇-龙胆三糖苷对人HepG2细胞中CRE的影响Fig.2 Effect of Egonol gentiotrioside on CRE in HepG2 of human

2.2 齐墩果醇-龙胆三糖苷对肝癌细胞 HepG2内cAMP作用元件的影响

图 2为齐墩果醇-龙胆三糖苷对 HepG2细胞胞内 CRE的影响。同样按照 2.2方法将 RLU值平均到同一转染水平。

从图 2可以看出,以空白组 RLU值为 1时,阳性组相比于空白组对照组为 2左右,差异极其显著(P＜0.01)。化合物齐墩果醇-龙胆三糖苷相较于空白对照组相对 RLU值为 9左右,差异极其显著(P＜0.01),显示了极强的提高 cAMP的作用。

2.3 齐墩果醇-龙胆三糖苷对肝癌细胞 HepG2增殖的影响

表1 齐墩果醇-龙胆三糖苷对HepG2细胞增殖的影响(x± )s,n=3Table 1 Effect of egonol gentiotrioside on HepG2 cell proliferation(±s,n=3)

表1 齐墩果醇-龙胆三糖苷对HepG2细胞增殖的影响(x± )s,n=3Table 1 Effect of egonol gentiotrioside on HepG2 cell proliferation(±s,n=3)

注:＊与空白对照组比较P＜0.05;＊＊与空白对照组比较P＜0.01。

组别 Group 剂量Dose 增殖率Proliferation rate(%)空白组Blank 0.00±0.00阳性组雌二醇 Estradiol 10 nmol/L 60.23±12.20＊＊齐墩果醇-龙胆三糖苷Egonol gentiotrioside 300μmol/L 15.03±2.97 30μmol/L 33.52±3.07＊3μmol/L 4.81±4.23 0.3μmol/L 2.34±1.18 0.03μmol/L 2.06±1.03

由表 1,齐墩果醇-龙胆三糖苷,在终浓度为 3、0.3、0.03μmol/L时对 HepG2细胞增殖率小于10%,t检验,结果无显著性差异,说明当齐墩果醇-龙胆三糖苷在上述终浓度下对 HepG2细胞没有明显促增殖作用,在 30μmol/L时达到最大增殖率33.52%,促 HepG2细胞增殖作用明显增强。

3 讨论

为探明齐墩果醇-龙胆三糖苷的雌激素样作用,我们选用了 pERE-Luc和 pCRE-Luc两种荧光素酶报告基因,从雌激素经典信号途径和非经典信号途径两个方面来检测齐墩果醇-龙胆三糖苷的雌激素样作用。

雌激素经典信号途径:雌激素与其特异受体结合后受体发生空间构象改变而形成二聚体,从而暴露 DNA结合区使特异DNA序列与之结合,即靶基因调节区的 ERE(雌激素作用元件)与之结合,并募集辅助因子形成转录启始复合物而启动基因转录[13]。雌激素致癌作用被认为是通过雌激素受体信号途径(经典信号途径介导),引起自发突变从而引起癌细胞的增殖[13]。我们通过 ERE报告基因来检测样品同雌二醇类似的与 ERE作用的现象。结果显示齐墩果醇-龙胆三糖苷具有与阳性药 17β-雌二醇几乎相等的作用,差异极为显著。进一步提示该化合物有类似雌激素样作用,并且可以激活雌激素经典信号途径。

在雌激素的非经典信号途径中,雌激素可通过细胞膜结合的雌激素受体或内质网膜结合的GPR30活化腺苷酸环化酶 (AC)[4]。雌激素激活AC后,可见 cAMP水平增高[14]。cAMP是细胞内的第二信使,在细胞活化、增殖及凋亡过程中有十分重要的作用。Forskolin是一种腺苷酸环化酶激活剂,它提高胞内 cAMP浓度的途径与 17β-雌二醇一致。在齐墩果醇-龙胆三糖苷对人 HepG2细胞 cAMP的影响试验中其相对 RLU值相较于空白对照组差异在 9倍左右,显示了极强的提高 cAMP的作用。进一步说明齐墩果醇-龙胆三糖苷在雌激素非经典途径上也有类雌激素作用。

雌激素对肝癌的影响虽然已经有相关报道称与雌激素的经典信号途径及非经典信号途径有关,但是其准确机制至今仍无定论。Vitale Miceli等人实验证实,雌激素对肝癌细胞有增殖作用,是通过与芳香酶活性相关的双调蛋白信号来实现的。HepG2细胞是 ERα(雌激素受体α)阳性的人肝癌细胞株,能特异性地受雌激素或雌激素样活性物质调节而增殖[13]。

在研究齐墩果醇-龙胆三糖苷的类雌激素作用对 HepG2细胞增殖影响时,我们选用了Alamar-Blue细胞增殖与活性检测试剂,避免了传统MTT法因为对细胞结构的破坏作用从而引起的结果误差,使数据结果更准确,操作更简便。本研究结果显示,齐墩果醇-龙胆三糖苷能在去激素培养条件下对 HepG2细胞增殖有一定作用,与阳性药 17β-雌二醇呈现的作用相同,表明齐墩果醇-龙胆三糖苷的类雌激素作用对 HepG2细胞增殖有促进作用。

本实验研究齐墩果醇-龙胆三糖苷类雌激素作用及其对人肝癌细胞 HepG2增殖的影响,目前该化合物在这方面的研究尚未见报道。实验结果显示齐墩果醇-龙胆三糖苷有类雌激素作用,且该作用促进HepG2增殖。该结论对评价该化合物作为药物研究的安全性及实验室后续的齐墩果醇-龙胆三糖苷类雌激素作用有重要价值。但本实验主要是从该化合物类雌激素作用方面进行其促人肝癌细胞 HepG2增殖的研究,也主要是针对化合物在转录水平的研究,还不能全面揭示它促进 HepG2增殖的机制。因此,应该通过建立其它相关模型,考察该化合物同雌激素激活的相关信号途径中的作用。

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Estrogen ic Activity of Egonol Gentiotrioside and Its Effect on HepG2 Cells Proliferation

YANGDi-xiao,L IQi-lin,ZHANG Guo-lin,WANG Fei＊
Chengdu Institute of B iology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041,China

Hepatocellular carcinoma is the third cause of cancer death worldwide,and clinical study indicates that estrogen and its receptors are involved in the hepatocellular carcigenesis.It is reported that the benzofuran has estrogenic activity.So,it’s important to evaluate the effect of estrogenic activity of egonol gentiotrioside on HepG2 cells proliferation. This compound possessed significant activity on promoting estrogen response element(ERE)and cAMP response element(CRE)in HepG2 cells that was transfected with pERE-Luc and pCRE-Luc luciferase reporter gene.Modified HepG2 cells proliferation assay was used to evaluate the estrogenic activity of egonol gentiotrioside.The result showed that egonol gentiotrioside possessed similar pro-proliferation effect as 17β-estradiol.These evidences indicated the estrogenic activity of egonol gentiotrioside is involved in HepG2 cells proliferation.

egonol gentiotrioside;estrogenic activity;HepG2 cell;ERE(estrogen responsive element);CRE(cAMP response element)

R285.5;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0697-05

2009-05-20 接受日期:2009-06-09

＊通讯作者 Tel:86-28-85256758;E-mail:wangfei@cib.ac.cn