7种不同蜜源蜂蜜的化学组成及抗氧化性

郭夏丽,罗丽萍＊,冷婷婷,付 婷,丁红秀

1南昌大学生命科学与食品工程学院,南昌 330031;2江西师范大学生命科学学院,南昌 330022

7种不同蜜源蜂蜜的化学组成及抗氧化性

郭夏丽1,罗丽萍1＊,冷婷婷1,付 婷1,丁红秀2

1南昌大学生命科学与食品工程学院,南昌 330031;2江西师范大学生命科学学院,南昌 330022

为了解不同蜜源蜂蜜的化学组成及抗氧化活性差异,并探索二者关系,本文较系统的研究了7种不同蜜源蜂蜜的化学组成及抗氧化性,为评价蜂蜜的保健功能提供了理论依据。实验采用分光光度法测定了蜂蜜色度、总酚和总黄酮含量;以 23种酚类化合物为对照品,利用高效液相色谱法 (High-performance liquid chromatography,HPLC)测定了蜂蜜中的酚类化合物;最后测定了蜂蜜的抗氧化能力。对上述指标进行相关性分析表明,色度值越大,蜂蜜中的总酚和总黄酮含量越高;蜂蜜的总酚含量与其抗氧化活性相关性极显著(R2=0.881＊＊);整体上表现出蜂蜜颜色越深,总酚与总黄酮含量越高,其抗氧化能力越强。

蜂蜜;总酚;总黄酮;总抗氧化能力;自由基清除活性

蜂蜜为蜜蜂科昆虫中华蜜蜂 (A ips ceranaFebricius)或意大利蜂 (A ips m elliferaLinnaens)采集植物花蜜或分泌物,经过充分酿造而贮藏在巢脾内的甜物质。其中,总糖量占 75%以上,水分 16%～25%,蛋白质平均含量 0.16%,此外还含有少量的挥发油、有机酸、花粉及多种酶类和微量元素。蜂蜜在世界范围内被广泛应用,是药品生产中很好的甜味剂、粘合剂、抗氧剂等[1]。药理实验证明,蜂蜜有润肠、护肝、抗菌、抗炎[2]、抗癌[3]等作用。因此,蜂蜜又被称为“天然抗生素”。

近年来,人们越来越关注具有药物治疗作用的抗氧化剂,天然食物中常常含有能清除自由基的天然抗氧化剂。与饮食有关的小分子抗氧化剂,如Vc、Ve和类萝卜素对抗衰老具有良好作用。然而,一些研究表明,酚类物质,如类黄酮和酚酸具有更强的抗氧化能力。蜂蜜中含有一些抗氧化剂,包括Vc、Ve、酶 (过氧化氢酶等)及一些酚类物质[4]。

国外对蜂蜜的化学组成研究报道较多,如总酚和总黄酮含量的测定,以及其抗氧化性的测定,而国内相对来说较少。本文选择了中国所产的 7种较为常见的蜜源蜂蜜为实验材料,对其色度、总酚、总黄酮含量和抗氧化活性进行了测定,并分析了各指标之间的相关性,旨在为中国蜂蜜的品质评价和消费者选购蜂蜜提供一些参考意见。

1 材料与方法

1.1 样品采集

市场上蜂蜜品种繁多,多以蜜源分类和定价。已有研究表明,蜂蜜颜色与其总酚含量和抗氧化能力有一定关系[5、6]。据此,经过市场调查后,选取了7种市场占用率较高、且从外观上观察具有颜色梯度的蜂蜜为实验材料。具体种类如下 (按照颜色由浅至深排列):洋槐蜜、紫云英蜜、党参蜜、土黄连蜜、龙眼蜜、枣花蜜,均由江西汪氏蜜蜂园有限公司提供;野桂花蜜由遂川大洲天然食品开发基地提供。7种蜂蜜表观特征见表 1。

1.2 化学试剂

DPPH·:Sigma-aldrich公司;肉桂酸、槲皮素、柚皮素、染料木素、山奈酚、芹菜素、p-香豆酸、阿魏酸为中药固体制剂制造技术国家工程研究中心产品;没食子酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡素、木犀草素、异鼠李素为中国药品生物制品检定所产品;杨梅酮、菲瑟酮、生松素为 Sigma-aldrich公司产品;桑黄素、黄芩素、α-儿茶素为君创生物科技有限公司产品;3, 4-二甲氧基肉桂酸、白杨素为上海精纯试剂有限公司产品;芦丁为中国医药 (集团)上海化学试剂公司产品;甲醇为色谱纯;其余试剂均为国产分析纯。

1.3 实验器材

JA1003N电子天平:精密科学仪器有限公司,上海;GZX-DH-50-55-s电热恒温干燥箱:跃进医疗器械厂,上海;HH-6数显恒温水浴锅:国华电器有限公司,江苏;7200可见分光光度计:尤尼柯仪器有限公司,上海;SHB-II IA型循环水式多用真空泵:河南太康教材仪器厂;KQ3200DE型数控超声波清洗器:昆山市超声仪器公司,江苏。

美国 Agilent 1200型高效液相色谱仪,包括在线脱气装置,四元泵,柱温箱,光电二级管阵列检测器 (DAD),手动进样装置,及 G2170BA LC化学工作站;50μL微量进样器。

1.4 蜂蜜色度的测定

将蜂蜜用蒸馏水溶解,配制成体积比 50%的工作液,在 450 nm下测定其吸光值。色度值以吸光度值计[8]。

1.5 蜂蜜中总酚含量的测定

准确吸取 1 mL稀释后的蜂蜜水溶液 (200 mg/ mL),加入 1 mL的 Folin-Ciocalteu试剂,混匀,然后加入 5 mL 1 mol/mL的Na2CO3溶液,用蒸馏水将混合液定容至 10 mL,混合均匀,在室温、避光条件下放置 1 h,于 760 nm处测定其吸光度值。试验数据平行测定 3次,结果用±sD表示。将对照品没食子酸配置成 0.1 mg/mL的标准溶液,按照上述方法制定标准曲线,根据标准曲线计算出样品中的总酚含量,蜂蜜总酚含量以没食子酸的相对量(mg GAC/ g honey)表示[7]。

1.6 蜂蜜中总黄酮含量的测定

准确吸取 2 mL 3 g/mL的蜂蜜水溶液于 20 mL容量瓶中,各瓶中分别加入 0.6 mL 15 g/100 mL的NaNO3溶液,再加入 0.6 mL 10 g/100 mL的 AlCl3溶液,8 mL 4 g/100 mL的 NaOH溶液,混匀后用蒸馏水定容至刻度。室温静置 15 min后,于 415 nm波长处测定吸光度值。将对照品槲皮素配置成 0.2 mg/mL的标准溶液,按照上述方法制定标准曲线。蜂蜜总黄酮含量以槲皮素的相对量表示[8]。

1.7 蜂蜜醇提物的HPLC分析

1.7.1 实验材料制备

蜂蜜中含有大量糖类大分子,采用 HPLC方法时,需将蜂蜜进行预处理,以免大分子堵塞高效液相色谱仪而造成损坏。具体步骤如下:取 100 g蜂蜜样品溶于 500 mL蒸馏水,用 HCl溶液调节至 pH 2.0,在室温下用磁力搅拌器搅拌均匀,然后通过过滤棉除去溶液中的固体颗粒。过滤后的溶液与 150 g Amberlite XAD-2(孔径为 9 nm,颗粒大小 0.3～1.2 mm)混合,用磁力搅拌器搅拌 10 min。将 Amberlite颗粒装在玻璃柱 (42×3.2)中,然后用酸水(250 mL,pH 2.0 HCl)冲洗柱子,随后用蒸馏水漂洗柱子以去除全部糖类物质及其它组分。酚类物质保留在柱中,用 400 mL甲醇将酚类物质洗出。甲醇提取物在 40℃条件下用旋转蒸发仪蒸干,残留物溶解于 5 mL蒸馏水,用乙醚(5 mL×3)提取。醚提取物混合后,在氮气条件下去除乙醚。干渣用甲醇复溶,配制成 10 mg/mL的蜂蜜醇提物。0.45μm滤膜过滤后进样[9]。

1.7.2 色谱条件

色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱 (4.6 mm×150 mm×5μm);流动相:甲醇 (流动相A)和0.1%甲酸-水溶液(流动相B);梯度洗脱,其时间程序为 0 min→10 min→20min→30 min→60 min→70 min→75 min→80 min;甲醇含量 0%→15%→17%→32%→42%→50%→65%→25%,流速:1.0 mL/ min;DAD检测波长:256 nm,280 nm;进样量 20 μL;柱温:35℃。

1.7.3 标准溶液的配制

分别称取各对照品 5 mg,置于 5 mL容量瓶中,加入甲醇溶解,用甲醇稀释至刻度,终浓度为 1 mg/ mL,经 0.45μm滤膜过滤后置于 4℃冰箱中避光保存,作为储备液备用,其他浓度对照品由储备液稀释得到。

1.8 蜂蜜总抗氧化性的测定

采用普鲁士兰法。准确吸取 1 mL各浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/mL)样液,加入 2.5 mL PBS缓冲液(0.2 M,pH 6.6),再加入 2.5 mL铁氰化钾溶液;50℃水浴20 min后,加入 2.5 mL三氯乙酸摇匀,取 7.5 mL样液,加入同体积双蒸水,再加入 1.5 mL FeCl3溶液。摇匀,静置 10 min,于 700 nm测定吸光值,以芦丁作阳性对照。蜂蜜总抗氧化能力以蜂蜜浓度-吸光值线性回归方程斜率 (K)表示[10]。

1.9 蜂蜜对DPPH·自由基的清除作用

将蜂蜜溶液用蒸馏水稀释成 0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、8.0 g/mL。分别取各浓度样液 0.1 mL,加入 3.9 mL 3～8 ug/mL DPPH·甲醇溶液 (现配现用),以 0.1 mL甲醇作空白。室温黑暗条件下静置 90 min后,于 517 nm测定其吸光值。

自由基清除率I%=(A0-AS)/A0×100%

A0——空白样品的吸光度值

AS——不同浓度的被测混合物的吸光度值

IC50(50%抑制浓度)可通过自由基清除活性 -样品浓度的线性关系求出[11]。

2 结果与讨论

2.1 7种蜂蜜的色度值、总酚和总黄酮含量

7种蜂蜜的色度值、总酚和总黄酮含量见表 1。由表 1可知,7种蜂蜜色度值及化学组成都有很大差异。其中,色度值最大为 1.028(龙眼蜜),最小为 0.329(洋槐蜜)。蜂蜜总酚含量最高为 28.222 ±0.117 mg/g(枣花蜜),最低为 11.578±0.257 mg/g(洋槐蜜),总酚含量除党参蜜和土黄连蜜差异显著外,其余蜂蜜之间均达差异极显著水平。蜂蜜总黄酮含量最高为 5.817±0.117 mg/g(枣花蜜),最低为 1.344±0.201 mg/g(野桂花蜜),除紫云英蜜与党参蜜总黄酮含量差异不显著外,其他蜂蜜差异均达极显著水平。7种蜂蜜中,除野桂花蜜外,表观颜色越深的蜂蜜,其色度值也越大。

表 1 7种蜂蜜表观特征、色度值、总酚和总黄酮含量Table 1 Apparent characteristics,color intensity,total phenol,total flavonoids of seven honeys

对 7种蜂蜜的总酚和总黄酮含量与色度进行相关性分析,结果见表 2。由表 2可知,7种蜂蜜的色度与总酚和总黄酮含量之间的相关性极显著,色度值值越大,总酚和总黄酮含量越高。这与 Jasna研究结果类似[5],Jasna等人对斯洛文尼亚地区蜂蜜色度及其总酚含量进行测定,并测得颜色较深的蜂蜜类型中总酚含量高,如冷杉蜜、云杉蜜、森林蜜,总酚含量分别为 241.4±39.5 mg/kg,217.5±20.6 mg/ kg,233.9±21.7 mg/kg。与颜色较浅的蜂蜜相比,颜色较深的蜂蜜总酚和总黄酮含量均比较高。说明不同颜色的蜂蜜在化学组成上存在差异。

2.2 7种蜂蜜的 HPLC分析结果

将对照品溶液制成 0.02 mg/mL单标工作液,分别在 200～400 nm波长范围内进行扫描,得到各对照品的紫外吸收峰。所扫描的 23种对照品中,吸收峰相对集中在 250,256,280,311,360 nm 5个波长。分别在上述 5个波长,对混合对照品进行检测。混合对照品在 256 nm和 280 nm两个检测波长下的出峰数及分离效果较好,故以这两个波长作为检测波长。对 7种蜂蜜色谱图进行相似度比较,见图 1。

对两个检测波长下 7种蜂蜜的 HPLC图谱相似度进行分析,7种蜂蜜在 256 nm波长下的相似度平均为 0.362±0.275。其中,紫云英蜜和枣花蜜色谱图相似度最高 (0.663),其次是龙眼蜜和枣花蜜(0.635),洋槐蜜和党参蜜图谱相似度最低。在280nm波长下的相似度为 0.352±0.343。其中,图谱相似度最高的也是紫云英蜜和枣花蜜(0.972),其次是党参蜜和枣花蜜 (0.829),相似度最低的同样是洋槐蜜和党参蜜。

表 2 7种蜂蜜总酚、总黄酮与色度相关性分析Table 2 Correlations of chemical compositions and color intensity of seven honeys

图 1 256 nm和 280 nm检测波长下蜂蜜色谱图相似度比较Fig.1 S imilarity comparison of chromatography of honeys at 256 nm and 280 nm detection wavelength

经过与标样对比保留时间和紫外吸收光谱,确定 7种蜂蜜中所含对照品种类及含量,结果见表 3。由表 3可知,7种蜂蜜均含有 3,4-二甲氧基肉桂酸、肉桂酸、杨梅酮、白杨素、生松素和阿魏酸,均不含有没食子酸和咖啡酸,香豆酸和槲皮素含量较低,柚皮素和 4,5,7-三羟黄烷酮含量较高;菲瑟酮、香豆酸、儿茶素和木犀草素是多数样品含有的成分。α-儿茶素、柚皮素、芹菜素、异鼠李素在各样品中的出现频率较低,α-儿茶素仅存在于土黄连蜜和龙眼蜜中,柚皮素仅存在于土黄连蜜和野桂花蜜中,芹菜素仅存在于龙眼蜜和野桂花蜜中,异鼠李素仅存在于土黄连蜜中。Lihu等[9]采用 HPLC方法对澳大利亚和新西兰的蜂蜜研究结果表明,多数蜂蜜中含有杨梅酮、槲皮素、木犀草素、3,4-二甲基氧基肉桂酸和一种未知类黄酮,与本文结果较为相似,均含有杨梅酮和 3,4-二甲基氧肉桂酸。Robert等[8]同样采用HPLC法测定结果却与本文差异较大,Robert测定的所有样品中均含有香豆酸、阿魏酸、没食子酸、龙胆酸、咖啡酸、柚皮素、莰菲素、4,5,7-三羟黄烷酮和槲皮素,且香豆酸含量较高,在百里香蜜中槲皮素含量特别高。蜜源植物和产地不同可能是造成这些差异的原因。

表 3 7种蜂蜜中各对照品含量 (mg/g honey)Table 3 Content of standards in seven honeys

-:未检测到。Not detected.

2.3 7种蜂蜜的总抗氧化性和清除 DPPH·自由基活性的测定结果

7种蜂蜜的总抗氧化性和清除 DPPH·自由基活性的测定结果见表 4。总抗氧化能力和清除 DPPH·自由基能力线性方程相关系数显示,蜂蜜浓度与总抗氧化能力、清除 DPPH·自由基能力线性关系良好。根据 Dina所述[10],利用普鲁士兰法测定总抗氧化剂活性时,反应液吸光值越大,抗氧化活性越强,即抗氧化剂浓度与吸光值线性关系斜率越大,其抗氧化能力越强。利用清除 DPPH·自由基法测定抗氧化性时,I C50值越小,表明对 DPPH·.清除效果越强。7种蜂蜜中枣花蜜总抗氧化能力和清除DPPH·自由基能力最强,分别为 1.9712和 1.321;最弱的为洋槐蜜,分别为 1.0736和 15.714。

表 4 7种蜂蜜总抗氧化能力及清除DPPH·自由基能力Table 4 Total antioxidant activities and DPPH· radical scavenging activities of seven honeys

2.4 蜂蜜化学组成及抗氧化活性之间的关系分析

7种蜂蜜抗氧化活性与其化学组成相关性分析结果见表 5。由表 5可知,蜂蜜总抗氧化能力与总酚含量相关性极显著,说明总酚含量越高,蜂蜜总抗氧化能力越强。蜂蜜总抗氧化能力与清除DPPH·自由基 IC50负相关性显著,说明总抗氧化能力越强,清除DPPH·自由基的活性越高。

本文测得,抗氧化能力方面,洋槐蜜最弱,枣花蜜最强。整体上表现出蜂蜜颜色越深,总酚与总黄酮含量越高,抗氧化能力越强,这与 Robert[8]、Jasna[5]和 A.M.Aljadi等[4]结论相似。对 7种蜂蜜进行市场调查,发现其售价不一,颜色最浅的洋槐蜜价格最高,而颜色最深的枣花蜜价格居中。因此,本文为消费者如何选购优质的蜂蜜提供了一些参考。

表 5 蜂蜜化学组成与抗氧化活性相关性Table 5 Correlations of compositions and antioxidant activities of honey

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Chem ical Compositions and Antioxidant Activities of Seven Honeys from D ifferent Floral Sources

GUO Xia-li1,LUO Li-ping1＊,LENG Ting-ting1,FU Ting1,D ING Hong-xiu2

1School of Life Science and Food Engineering,Nanchang University,Nanchang 330031,China2School of Life Science,Jiangxi Nor m al University,Nanchang 330022,China

Chemical compositions and antioxidant activities of seven common honeys in China were researched and the relationships be tween them were studied in the paper.Spectrophotography was used to determine color intensity,total phenol,total flavonoids of honeys.Twenty-three phenolic compoundswere selected as standards for high performance liquid chromatographymethod(HPLC)to detect the phenolic compounds of honeys.The antioxidant activities,including the radical scavenging assay and total antioxidant power,were deter mined by DPPH· radical scavenging assay and Prussian blue spectrophotometry respectively.The resultsof the study showed that totalphenol and flavonoids content and color intensitywere different remarkably among different honeys.The higher the color intensity was,the higher the total phenol and flavonoids content in honeyswere.The correlations between the totalphenol content and antioxidant activities were significantly remarkable(R2=0.881＊＊).In general,the darker honeys exhibited a higher antioxidant activities and contained higher total phenol compounds and flavonoids.

honey;total phenol;total flavonoids;total antioxidant activity;radical scavenging activity

0629.9

A

1001-6880(2010)04-0665-06

2009-07-20 接受日期:2010-01-06

国家自然科学基金 (C30700105);江西省青年科学家(井冈之星)培养计划资助(S00590)

＊通讯作者 Tel:86-791-3969519;E-mail:lluo2@126.com