一种云芝发酵所产胃蛋白酶抑制剂的纯化及部分性质研究

刘 琦,田亚平

江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122

一种云芝发酵所产胃蛋白酶抑制剂的纯化及部分性质研究

刘 琦,田亚平＊

江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122

云芝发酵液经超声波细胞破碎,离心和大孔树脂脱色得上清液。上清液再经 DEAE-52、Mono Q离子交换层析和UltroGelACA-54凝胶过滤分离得到一种胃蛋白酶抑制剂。它的成分是蛋白质,经UltroGelACA-54凝胶过滤和 SDS-PAGE鉴定为单亚基,相对分子量为 22.31 kDa。该抑制剂热稳定性良好,对胃酶有很强的抑制作用,半抑制浓度 IC50值为 29.26μg/mL,抑制类型属于非竞争和反竞争混合型抑制模式,其Ki值为 0.996μmol/ L。

云芝;胃蛋白酶抑制剂;纯化;层析

天冬氨酸蛋白酶的活性中心一般是由两个天冬氨酸残基所组成,目前主要包括胃蛋白酶 (pepsin)、胃亚蛋白酶 (gastricsin)、凝乳酶 (chymosin)、溶酶体(组织蛋白酶D和 E)、肾素 (renin)、蛋白酶 A(proteinase A)及艾滋病病毒 (H IV)蛋白酶等[1]。天冬氨酸蛋白酶抑制剂在食品保健及医药行业中应用非常广泛[2],如抑制肿瘤细胞增殖、增强免疫力和抗癌等,对胃溃疡、降血压、艾滋病、中风、老年痴呆症等的治疗具有明显的疗效[1]。而化学法合成天冬氨酸蛋白酶抑制剂往往因其药理毒性和安全性得不到保证(如 H IVPI沙奎那韦可导致脂代谢紊乱综合症),所以在食品及医药行业中的应用受到很大的限制[3],因此从天然产物中开发此类蛋白酶抑制剂日益受到人们的关注。

云芝深层发酵易于规模化、大量生产,以土豆汁作为培养基具有取材易,成本低,使用安全,杂质相对较少,应用广泛等优点[4]。利用云芝发酵制备胃蛋白酶抑制剂(天冬氨酸蛋白酶抑制剂的一种),除对胃蛋白酶具有抑制作用外,还可能兼有云芝多糖和云芝糖肽等的活性功能,保证了其应用的安全性,在医药保健及食品添加剂等方面将有很好的应用前景。

本论文对以胃蛋白酶作靶酶从云芝发酵液中筛选出的一种有较强抑制效果的蛋白酶抑制剂进行了分离纯化和部分性质方面的研究,为更好地揭示和开发其药理价值和应用潜力奠定了基础。目前国内外尚无从天然产物中开发胃蛋白酶抑制剂的报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

云芝 (Coriolus versicolor),菌株购自华中农业大学菌种实验中心。

DEAE-52离子交换色谱柱 (20 cm×2.2 cm)、Mono Q离子交换色谱柱 (10 cm×0.46 cm)、ACA-54凝胶色谱柱 (80 cm×1.4 cm)购自安法玛西亚生物技术有限公司;紫外检测器 (上海沪西仪器厂);示差检测器串联、进口双针记录仪 (德国 Hettich公司);胃蛋白酶 (国药集团化学试剂有限公司);血红蛋白(上海丽珠东风生物技术有限公司);其余试剂为国产分析纯级。

1.2 方法

1.2.1 培养基

斜面培养基:采用 PDA培养基。种子培养基: 95%土豆汁,5%麸皮,玻璃珠 (30粒/瓶)。摇瓶发酵培养基:纯土豆汁,玻璃珠(20粒/瓶)。

1.2.2 摇瓶发酵产胃蛋白酶抑制剂

活化的菌株接种于纯土豆汁培养基 (pH 6.2,1 ×105Pa,20 min),于摇床 180 r/min,28℃培养 120 h后,将发酵液超声波细胞破碎,12000 r/min离心20 min,再经大孔树脂脱色得上清液,透析后用于抑制剂的纯化。

1.2.3 胃蛋白酶活力测定

采用常规蛋白酶测定法[5]。酶活单位定义:在最适条件下,每分钟分解底物产生 1μg的酪氨酸定义为一个酶活单位,即 1 u。

1.2.4 抑制率计算

抑制率 =(抑制前酶活 -抑制后酶活)/抑制前酶活 ×100%

1.2.5 抑制活力单位定义

在测定胃蛋白酶活力的条件下,定义抑制率每下降 10%为一个抑制活力单位,即 1 U。

1.2.6 蛋白质浓度测定

采用 Lowry法[6],以牛血清白蛋白做标准曲线。

1.2.7 糖浓度测定

采用苯酚-硫酸法[6],以葡萄糖为对照制作标准曲线。

1.2.8 蛋白酶抑制剂的纯化

DEAE-52离子交换层析:流动相 A液为 0.02 mol/L的磷酸缓冲液 (pH 6.8),B液为 0.02 mol/L的磷酸缓冲液(含 0.6 mol/L NaCl溶液,pH 6.8)。以A液洗脱 2倍柱床体积后,以 20%B液阶段梯度洗脱,超声破碎的发酵液离心透析后上样,流速为1.5 mL/min,进样量 10 mL。

Mono Q离子交换层析:流动相 A液为 0.02 mol/L的磷酸缓冲液 (pH 6.8),B液为 0.02 mol/L的磷酸缓冲液(含 0.3 mol/L NaCl溶液,pH 6.8)。以A液洗脱 2倍柱床体积后,以 0%B～50%B液线性梯度洗脱 3倍柱床体积,50%B～100%B液线性梯度洗脱 7倍柱床体积,最后以 B液洗脱 3倍柱床体积。流速为 1.5 mL/min,进样量 2 mL。

UltroGelACA-54凝胶过滤层析:洗脱剂为 0.02 mol/L,pH 6.8的磷酸缓冲液,洗脱速度 0.7 mL/ min,进样量 3 mL。

1.2.9 抑制剂纯度鉴定以及分子量的测定

相对分子质量测定:采用凝胶过滤法[7]。用UltroGelACA-54层析柱。亚基相对分子质量确定:用 SDS-PAGE法[7],分离胶浓度 15%,浓缩胶浓度5%。

1.2.10 胃蛋白酶抑制剂的性质

胃蛋酶抑制剂热稳定性试验:将抑制剂分别置于 0、20、40、60、80和 100℃的水浴中处理 1 h,考察其在 0～100℃范围内对胃蛋白酶的抑制效果。

胃蛋白酶抑制剂对底物特异性研究:在 pH 5.0,反应时间为 1 h的条件下,考察抑制剂对不同来源的蛋白酶如胃蛋白酶、Pr A、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的抑制效果,其方法与测定胃蛋白酶活力的方法一致。

对胃蛋白酶半抑制浓度 I C50的测定:在 pH 5.0,反应时间为 1 h的条件下,测定不同浓度的抑制剂对胃蛋白酶的抑制率,将抑制率和其对应的蛋白浓度进行作图,根据曲线确定 IC50值。

抑制动力学研究:将抑制剂稀释到一定的浓度与胃蛋白酶混合,以不同浓度的血红蛋白作底物进行反应[8]。

2 结果与讨论

2.1 胃蛋白酶抑制剂的纯化

2.1.1 DEAE-52离子交换层析

将透析后的发酵液经过 DEAE-52离子交换层析,结果如图 1,在盐浓度为 0.2 mol/L时的洗脱峰4、峰 5有抑制活性,取抑制活性较高的峰 5继续进行分离纯化。

图1 DEAE-52离子交换层析Fig.1 I on-exchange chromatography on DEAE-52

2.1.2 Mono Q离子交换层析

收集上步的洗脱峰 5,透析浓缩后经过MonoQ离子交换层析 (图 2),线性洗脱,出现四个洗脱峰,经检测在盐浓度为 0.196 mol/L时的洗脱峰Ⅱ有抑制活性。

2.1.3 UltroGelACA-54凝胶过滤层析

将上步有抑制效果的峰Ⅱ浓缩后经过ACA-54,结果出现三个蛋白质峰 (图 3),经测定峰 c有抑制活性,用苯酚-硫酸法测糖含量,该蛋白质样品中没有糖,说明该蛋白不是糖蛋白。

2.2 抑制剂纯度鉴定以及分子量的测定

用胰蛋白酶,胃蛋白酶,卵清蛋白,牛血清白蛋白为标准样品,并以洗脱体积Ve对 lg Mr做图得UltroGelACA-54分子量标准曲线。由抑制剂的洗脱体积算出其分子量约为 23 kDa。SDS-PAGE鉴定抑制剂为单一条带,相对分子质量为 22.31 kDa,与凝胶过滤法测定结果基本一致,说明抑制剂为单亚基。

表 1 胃蛋白酶抑制剂的提纯结果Table 1 Purification of pepsin inhibitor

2.3 胃蛋白酶抑制剂的性质

2.3.1 抑制剂热稳定性试验

于 0～100℃的环境下测定抑制剂的稳定性,由图 5可以看出,此 0～80℃范围内,抑制率变化稳定在 50%～60%之间,表明抑制剂热稳定性良好。

2.3.2 抑制剂对底物的特异性研究

结果如图 6可知,抑制剂对胃蛋白酶的特异性很强,其次对天冬氨酸族的蛋白酶 A和木瓜蛋白酶也有一定的抑制效果。

2.3.3 抑制剂对胃蛋白酶的半抑制浓度测定

由图 7可知,抑制剂对胃蛋白酶的半抑制浓度为 29.26μg/mL。从灵芝发酵全粉中提取得到的蛋白酶抑制剂对胃蛋白酶的半抑制浓度为 180μg/mL[9],表明云芝发酵产生的胃蛋白酶抑制剂对胃蛋白酶有较强的抑制活性。

图 4 胃蛋白酶抑制剂的 SDS-PAGE图谱Fig.4 Graph of SDS-PAGE of pepsin inhibitor

图 7 抑制剂用量对抑制活性的影响Fig.7 Effect of different inhibitor content on inhibition

2.3.4 抑制剂对胃蛋白酶的抑制动力学研究

用 Lineweaver-Bunk双倒数法作图[8],得图 8、图9。

从图 9结果判断抑制剂的抑制作用既类似于非竞争性抑制又类似于反竞争性抑制,称这种抑制类型为非竞争性与反竞争性混合型[10]。根据Km/Vm ×(1+[I]/Ki)=0.0306,其中[I]=0.97(μmol/ L),求得Ki=0.996(μmol/L)。

3 结语

云芝发酵液经过分离纯化得到电泳纯的胃蛋白酶抑制剂,最终蛋白回收率为 3.29%,纯化倍数为35.9。

本文对胃蛋白酶抑制剂的性质进行研究,为其应用开发奠定理论基础。因胃蛋白酶抑制剂有很好的临床应用前景,如可以用于治疗胃炎,胃溃疡等疾病[11],因此对于其具体的结构、作用机理、以及结构与功能之间的关系有待进一步探讨。

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4 Kim MH,Park SC,Kim JY,et al.Purification and character

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6 Tian YP(田亚平).Biochemistry Separation Technique(生化分离技术).Beijing:Chemistry Industry Press,2006.313-315.

7 Li JW(李建武),Xiao NG(肖能庚),Yu RY(余瑞元),et al.Principle andMethod ofBiochemistry Exper iments(生化实验方法和技术).Beijing:Beijing University Publishing House,1994.189-326.

8 Li YS(李屹松),Tian YP(田亚平).The kinetic characteristics of proteinase A inhibitor GLP IA.J Food Sci B iotech(食品与生物技术学报),2005,24(3):84-86.

9 Tian YP(田亚平),Zhang KC(章克昌).Purification and characteristic of proteinase inhibitor GLP IA2 fromGanoderm a lucidumby submerged fermentation.Chrom atography(色谱),2005,2:267-269.

10 Brett I Pletschke,Brizin J,Kay H,et al.Ostrich PepsinsⅠandⅡ:A kinetic and thermodynamic investigation.J B iochem Cell B iol,1995,27:1293-1302.

11 Yu SK(于善凯),Zhang Y(张英),Wu XQ(吴小琴).Nutrient content and biological activity of chrysanthemum.Food Nutr China(中国食物与营养),2002,2:50-51.

Purification and Characterization of Pepsin Inhibitor from Fermentation byCoriolus versicolor

L IU Qi,T IAN Ya-ping＊
The Key Laboratory of Industrial B iotechnology,M inistry of Education,Jiangnan University,W uxi 214122,China

In this study,a kind of pepsin inhibitor produced in liquid state fer mentation byCoriolus versicolorwas pretreated by ultrasonic cell disruption,centrifugation,decolorized by a macroporous resin,and then isolated by DEAE-52, Mono Q ion-exchange chromatography and UltroGelACA-54 gel-filtration.Itwas identified to be a protein and showed a single subunit by the methodsofUltroGelACA-54 gel-filtration and SDS-PAGE,the relative molecularweightwas 22.31 kDa.The purified inhibitor remained stable at the range of 0-80℃,and had specific inhibition to pepsin,the IC50to pepsin was 29.26μg/mL,the inhibitory type was the complex of non-competitive and anti-competitive inhibitorymode,and the Kiwas 0.996μmol/L.

Coriolus versicolor;pepsin inhibitor;purification;chromatography

Q503;Q502;R285

A

1001-6880(2010)04-0647-05

2008-09-25 接受日期:2008-11-06

＊通讯作者 Tel:86-510-85918116;E-mail:yapingtian@hotmail.com