高效液相色谱法测定复方替硝唑洗剂中主药的含量

王琤帅，吴韶铭

（浙江省金华市食品药品检验所，浙江 金华 321000）

复方替硝唑洗剂是浙江省金华市第五医院自制妇科炎症外用制剂，由替硝唑、醋酸氯己定、冰片和其他辅料组方，收载于2005年版《浙江省医疗机构制剂规范》，分别采用分光光度法和双波长吸收法测定含量。笔者参阅相关文献[1－3]，建立了能同时测定该制剂中替硝唑和醋酸氯己定含量的高效液相色谱（HPLC）法。报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱系统(包括四元梯度泵、紫外检测器、Agilent 1100 LC化学工作站)，Mettler AE240S型电子天平。替硝唑对照品（批号为100336－200402），醋酸氯己定对照品（批号为100183－199902)，均由中国药品生物制品检定所提供；复方替硝唑洗剂（规格为 250 mL，批号为 071225，080512，080617，金华市第五医院制剂室，甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：岛津 VP－ODS柱(150 mm ×4.6 mm，5!m)；流动相：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾4 g、三乙胺2.5 mL、庚烷基磺酸钠1 g，加水至 1 000 mL，用磷酸调 pH 至 2.5)－甲醇(40∶60）；流速：1.0 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：35 ℃；进样量：20!L。

2.2 溶液制备

分别精密称取替硝唑对照品75.2 mg和醋酸氯己定对照品13.1 mg，置100 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液（每1 mL中分别含替硝唑和醋酸氯己定0.752 mg和0.131 mg）。精密吸取样品5 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，进样前用0.45!m滤膜过滤，即得供试品溶液。按处方组成，取除替硝唑和醋酸氯己定以外的群药，制成空白制剂，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

干扰试验：在该色谱条件下，吸取替硝唑对照品溶液、醋酸氯己定对照品溶液适量，分别进样，以确定两成分的保留时间；再分别吸取2.2项下3种溶液，注入液相色谱仪。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上有相同保留时间的峰，而阴性对照品溶液在此保留时间无干扰，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取混合对照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置 10 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件测定，以峰面积 A为纵坐标、质量浓度 C（mg/mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程替硝唑 A=8 454.694 0 C+24.594 6，r=0.999 8(n=6)；醋酸氯己定 A=55 998.512 6 C+16.221 1，r=0.999 9(n=6)。结果表明，替硝唑和醋酸氯己定的质量浓度分别在 37.6～376!g/mL和 6.55～65.5!g/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验：精密吸取同一质量浓度的混合对照品溶液，重复进样，结果替硝唑及醋酸氯己定的峰面积平均值分别为1 291和1 465，RSD 分别为 0.31%和 0.57%(n=6)。

重现性试验：取同一批样品，依法制备供试品溶液，分别进样。结果替硝唑及醋酸氯己定平均含量分别为3.018 1 mg/mL和0.506 0 mg/mL，RSD 分别为 0.43%和 0.49%(n=6)，表明方法重现性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于 0，2，4，8，12 h 时依法测定，结果替硝唑与醋酸氯己定峰面积的 RSD分别为0.45%和0.54%(n=5)，表明该溶液在12 h内稳定性良好。

加样回收试验：精密吸取样品5 mL，置100 mL量瓶中，共6份，分别精密加入混合对照品溶液4，5，6 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液，依法测定含量。结果见表1。

表1 替硝唑和醋酸氯己定加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取不同批号的供试品3批，按照供试品溶液制备方法处理并测定。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

最大吸收波长替硝唑在310 nm附近，醋酸氯己定在259 nm附近，考虑到处方中替硝唑的量是醋酸氯己定的6倍，而替硝唑在259 nm波长处的吸收也较强，故测定波长选择260 nm，以使两成分的峰面积相近。

流动相及其pH对试验结果影响较大。笔者曾用乙腈－水（35∶65）、甲醇 －水（60∶40）等不同比例的流动相，结果出峰时间太快且峰形不好。而选用甲醇－水－三乙胺（60∶40∶0.7）或者乙腈－甲醇－水－三乙胺（20∶50∶30∶0.7）同样存在出峰时间过快，且醋酸氯己定峰的对称性不佳。最后选择加离子对试剂庚烷基磺酸钠，同时调节pH，庚烷基磺酸钠与醋酸氯己定形成离子对，改善了峰形。同时测试了加辛烷基磺酸钠作为离子对试剂，结果没有明显的差异。故最终选择文中的色谱条件，可使醋酸氯己定出峰稳定，且峰面积及保留时间适中。

[1]黄宝立，张 华.HPLC法测定口含片中替硝唑与氯己定的含量[J].西北药学杂志，2000，15（2）：51.

[2]钱 方，黄 伟，王雯洁，等.高效液相色谱法测定复方替硝唑漱口液中主药的含量[J].中国药房，2003，14（5）：298.

[3]郑 芳，朱雪松，何 婧.反相高效液相色谱法测定复方替硝唑栓三组分含量[J].医药导报，2007，26（11）：1 367.