屠宰场生鸡肉肠炎沙门氏菌的污染途径

李继祥，高继业，唐 妤，丁孟建，朱周福

(西南大学荣昌校区，重庆 402460)

屠宰场生鸡肉肠炎沙门氏菌的污染途径

李继祥，高继业，唐 妤，丁孟建，朱周福

(西南大学荣昌校区，重庆 402460)

目的：研究屠宰场生鸡肉肠炎沙门氏菌的主要污染途径。方法：以屠宰场生鸡肉样品为研究对象，在利用多聚酶链反应(PCR)检测肠炎沙门氏菌污染的基础上，通过流行病学的方法研究生鸡肉污染与肉鸡感染的关系。结果：屠宰场生鸡肉样品肠炎沙门氏菌污染阳性率为9.03%(26/288)，样品污染与样品来源屠宰场间无统计学联系，但与养殖场的肉鸡感染肠炎沙门氏菌有联系；养殖场肉鸡感染肠炎沙门氏菌与生鸡肉污染有正的统计学联系(相对危险性=18.5)；肉鸡实验性感染肠炎沙门氏菌后的带菌时间可达42d，排菌达56d以上。结论：屠宰场生鸡肉肠炎沙门氏菌的污染途径主要为内源性污染。

肠炎沙门氏菌；屠宰场生鸡肉；污染途径；内源性污染

Abstract ：Objective: To explore main contamination pathways of raw chicken by Salmonella enteritidis in slaughterhouses.Methods: The contamination of Salmonella enteritidis in raw chicken samples from different slaughterhouses was detected by polymerase chain reaction (PCR). The relationship between the contamination of raw chicken and the infection of broilers was investigated. Results: A total of 288 samples from 5 slaughterhouses were detected, and the results showed that 9.03% of them were contaminated by Salmonella enteritidis. No significant difference was observed among raw chicken samples from different slaughterhouses; however, the number of contaminated samples was positively correlated with the infection of Salmonella enteritidis during the nursery of broilers (the relative risk was 18.5). The experimental infected broilers harbored Salmonella enteritidis for 42 days and the length of bacteria excretion was approximately 56 days. Conclusion: Endogenous contamination is the predominant contamination pathway by Salmonella enteritidis in raw chicken from slaughterhouses.

Key words：Salmonella enteritidis；raw chicken from slaughterhouse；contamination pathway；endogenous contamination中图分类号：R155.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)15-0208-04

沙门氏菌是世界范围内最为重要的食物源性病原之一，30%食物源性细菌污染是由其引起的。沙门氏菌血清型众多，对公共卫生具有重要意义的是肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。肠炎沙门氏菌有鞭毛，能运动，对人和动物有侵害性且引起多种不同临床表现，主要通过污染禽肉和禽蛋来威胁公众健康[1-2]。在美国，鸡肉肠炎沙门氏菌污染越来越严重，2005年的污染阳性率比2000年提高了4倍[3]；法国和巴西的冻鸡肉[4]、西班牙屠宰场的肉鸡胴体[5]中肠炎沙门氏菌污染普遍存在；土耳其商店中销售的生鸡肉污染率为6.00%～33.33%[6]。在我国某些地区，肠炎沙门氏菌已成为危害肉鸡养殖的主要病原性细菌之一，肉鸡的感染率或发病率高达50%以上[7-8]，但生鸡肉中肠炎沙门氏菌污染尚未见报道。肠炎沙门氏菌可通过外源性途径和内源途径污染生鸡肉，前者是指在屠宰、加工、销售等过程中的污染，后者是指肉鸡生前感染或携带病菌而导致的污染。本研究在利用多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测屠宰场生鸡肉中肠炎沙门氏菌污染的基础上，利用流行病学方法研究污染的主要途径，为采取合理措施降低污染程度提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鸡肉：于2007年12月至2008年3月从重庆、四川地区的5个肉鸡屠宰场采集样品，每个屠宰场采集6批，每批屠宰肉鸡来源于同一养殖场，共采集了30个养殖场的样品。生鸡肉样品为颈部皮肤复合物，在每批肉鸡屠宰的前、中、后3个时间段分别抽取3～4只鸡，每只鸡采集30g左右。生鸡肉样品置于冰盒内送检。

Taq DNA 聚合酶(5U/μL)、10×PCR 缓冲液、MgCl2(25mmoL/L)、dNTPs (10mmoL/L)、DL 2000 DNA Marker大连宝生物工程公司；核酸染料(Gold ViewTMNucleic Acid Strain) 赛百盛生物技术公司。

SOC培养基按文献[9]配制。

1.2 方法

1.2.1 生鸡肉中肠炎沙门氏菌的检测

生鸡肉样品匀浆后置于盛有SOC培养基的三角烧瓶中，37℃空气浴中振荡培养16h，静置5min，以上层菌悬液提取的细菌基因组DNA为模板进行肠炎沙门氏菌sefA基因的PCR扩增检测[10-11]。

1.2.2 屠宰场生鸡肉肠炎沙门氏菌污染的溯源调查

将检测样品按来源肉鸡所属养殖场进行统计并确定阳性样品的来源场，将检出阳性样品的所有养殖场作为污染组，而其余养殖场为对照组。通过询问和查阅养殖记录等方式进行回顾性调查，搜集养殖场各种可能的危险因素。同时对各养殖场进行现场调查，了解存栏肉鸡的健康状况，并对出栏肉鸡追踪采样检测。根据回顾性和现场调查结果，推断与屠宰场生鸡肉肠炎沙门氏菌污染有联系的危险因素。

1.2.3 养殖场肉鸡感染肠炎沙门氏菌对生鸡肉污染的影响

于2008年3月在某肉鸡养殖地区，利用前瞻性实验设计(即队列研究)对养殖场肉鸡感染肠炎沙门氏菌对生鸡肉污染的影响进行研究。以细菌分离鉴定确诊为肠炎沙门氏菌感染的8个三黄肉鸡群组成暴露组[10]，由肉鸡品种、日龄和饲养方式等相同的8个非感染鸡群组成对照组；对暴露组和对照组各鸡群进行追踪采样检测。

1.2.4 肉鸡实验性感染肠炎沙门氏菌

将来源于没有免疫肠炎沙门氏菌疫苗的健康三黄肉鸡养殖场的受精卵在实验室条件下孵化，饲养至10日龄用于实验性感染。100只实验鸡随机分为实验组和对照组，每组50只，严格隔离饲养。实验组每只鸡经口接种1mL肠炎沙门氏菌CQ0709株[7]菌悬液(相当于5倍 LD50剂量)，而对照组动物口服同等剂量灭活菌悬液。各组于实验的第2、7、14、21、28、35、42、49、56天时随机捕杀3只，分别采集颈部皮肤复合物、肝、脾和泄殖腔拭子进行肠炎沙门氏菌检测。

1.2.5 数据分析

用卡方(χ2)检验对计数资料进行差异显著性分析，相对危险性(relative risk，RR)=暴露组的样品污染率/对照组的样品污染率[12]。

2 结果与分析

2.1 屠宰场生鸡肉肠炎沙门氏菌污染

表1 屠宰场生鸡肉肠炎沙门氏菌污染Table 1 Contamination of raw chicken by Salmonella enteritidis in different slaughterhouses

屠宰场生鸡肉肠炎沙门氏菌污染的检测结果见表1。从5个屠宰场采集的30批288份生鸡肉样品中检出26份肠炎沙门氏菌污染样品，样品污染率为9.03%(26/288)。各屠宰场的样品污染率分别为7.41%、11.48%、8.70%、8.93%和8.33%，无统计学差异(P＞0.05)。从9批生鸡肉样品中检出污染样品，即屠宰场1的第1批和第4批、屠宰场2的第2批和第5批、屠宰厂3的第3批和第6批、屠宰厂4的第1批和第4批及屠宰场5的第2批样品，而其余21批样品均未检出污染样品。由于每批屠宰肉鸡来源于同一养殖场，根据以上结果推测，屠宰场生鸡肉肠炎沙门氏菌污染与肉鸡养殖场有联系。

2.2 对鸡肉养殖场的回顾性和现场调查

污染组和对照组分别由9个和21个养殖场组成，所有养殖场均位于某肉鸡养殖地区，其饲养方式、规模、肉鸡品种、饲料、免疫接种等一致。污染组的肉鸡生长速度比对照组慢，一般推迟7～10d出栏。污染组的各养殖场在以往的肉鸡养殖过程中存在肠炎沙门氏菌感染，肉鸡的发病日龄在7～50日龄、发病率在10%～20%左右，病死鸡主要表现为肝、心和气囊的纤维素性渗出性炎症，而对照组的养殖场无该病流行。

在现场调查中，对照组的存栏肉鸡没有发现明显的异常；污染组的存栏肉鸡个体发育不整齐、约30%～40%的个体明显低于正常标准，部分肉鸡精神不振，排出白色稀粪，病理剖检表现为心包膜增厚与心包积液，从肝组织中能分离出肠炎沙门氏菌。对污染组和对照组出栏肉鸡追踪检测结果见表2。

表2 生鸡肉肠炎沙门氏菌污染的追踪调查Table 2 Tracking investigation of raw chicken contaminated by Salmonella enteritidis

由表2可知，从污染组的80份及对照组的175份生鸡肉样品中分别检出21份和5份污染样品，二者间差异极显著(χ2=30.31，P＜0.01)。以上结果表明，与屠宰场生鸡肉污染有关的危险因素是养殖场肉鸡感染肠炎沙门氏菌。

2.3 养殖场肉鸡感染肠炎沙门氏菌对生鸡肉污染的影响

表3 肉鸡肠炎沙门氏菌感染与生鸡肉污染的关系Table 3 Relationship between broilers infected by Salmonella enteritidis and contamination of raw chicken

暴露组和对照组生鸡肉中肠炎沙门氏菌检测结果见表3。经卡方检验，暴露组和对照组生鸡肉肠炎沙门氏菌污染差异极显著(χ2=11.7，P＜0.01)。暴露组和对照组的污染样品率分别为25.33%(19/75)和1.37%(1/73)，由感染导致生鸡肉污染的相对危险性(RR)为18.5。结果表明，养殖场肉鸡感染肠炎沙门氏菌与生鸡肉的污染有正的统计学联系。

2.4 实验性感染肉鸡的带菌和排菌时间

实验组10日龄肉鸡经口接种5倍 LD50剂量的肠炎沙门氏菌后2d内全部发病，表现为精神沉郁、食欲降低、两翼下垂、不愿走动、腹泻等临床症状；死亡动物表现为纤维素性肝周炎、心包炎和气囊炎，脾肿大，肠黏膜充血、出血、坏死等病变；12只死亡动物的肝、脾、皮肤复合物和泄殖腔拭子均检出肠炎沙门氏菌，而不同时间捕杀动物的检测结果见表4。对照组动物在实验过程中未见明显异常，捕杀动物采集的样品均未检测出肠炎沙门氏菌。结果表明，肉鸡感染肠炎沙门氏菌后肝、脾和皮肤复合物的带菌可达42d，从粪便排菌达56d以上。

表4 实验性感染肠炎沙门氏菌的肉鸡检测Table 4 Detection of Salmonella enteritidis in experimental infected broilers

3 讨 论

食品中沙门氏菌检测的常规方法是建立在细菌分离鉴定的基础之上，包括选择性和非选择性增菌培养、细菌分离、生化与血清学鉴定等5个步骤，具有费用高、操作复杂、费时等缺点，不适合批量样品的检测[13-14]。多聚酶链反应具有敏感性高、特异性强和快速等优点，已用于动物性食品中多种病原性细菌的检测[15-16]。SEF14菌毛是肠炎沙门氏菌特有的毒力因子，能使细菌牢固地附着于易感宿主消化道和生殖道的黏膜上皮细胞，从而引起宿主机体产生多种病理损伤。sefA是SEF14菌毛的主要结构亚单位，相对保守，其编码基因(sefA基因)可作为PCR方法鉴定肠炎沙门氏菌的靶基因，即使用于肉品和禽蛋中肠炎沙门氏菌的检测也具有很好的敏感性和特异性[11,17]。因此，在本研究工作中，选择sefA基因的PCR扩增检测作为生鸡肉中肠炎沙门氏菌的检测方法。

肠炎沙门氏菌作为沙门氏菌属细菌的重要成员，主要寄居于人和动物，尤其是家禽的肠道，引起肠道病变，同时也可以导致肠道外其他脏器病变或全身性感染。就生鸡肉肠炎沙门氏菌的污染而言，既可通过内源性途径(即肉鸡在屠宰前感染)污染，也可通过屠宰、生鸡肉的贮藏与运输等外源性途径污染[18-19]。本实验采集了5个屠宰场的288份生鸡肉样品进行检测，结果分析发现肠炎沙门氏菌污染与屠宰场不存在统计学的联系，但与肉鸡来源的养殖场有关。由此推测，生鸡肉的污染与养殖场中鸡群肠炎沙门氏菌感染有关。回顾性调查、现场调查及存栏肉鸡的追踪检测结果证明推测是正确的。为了进一步证实鸡群感染肠炎沙门氏菌是导致生鸡肉污染的主要途径，本实验还进行了前瞻性研究，其结果表明，鸡群肠炎沙门氏菌感染与生鸡肉污染有正的统计学联系(RR=18.5)。综上所述，屠宰场生鸡肉中肠炎沙门氏菌的污染主要来自于肉鸡感染导致的内源性污染。

在本实验调查地区，肉鸡以农户饲养为主，养殖规模在5000羽左右，多采用垫料地面平养，普遍存在从业人员专业素质低、饲养密度大、通风条件不良及不同日龄鸡混养等问题，这为肠炎沙门氏菌的感染和再感染提供了有利的条件[20]。实验性感染结果表明，肉鸡感染肠炎沙门氏菌后的带菌和排菌时间长，呈现持续性感染的特点，这与文献[21]的结果一致。长时间排菌可导致动物群体中更多的个体感染与再感染，长时间带菌直接导致感染鸡屠体污染机会增加。因此，科学饲养，控制鸡群肠炎沙门氏菌感染在防止生鸡肉污染中具有重要作用。

[1] FOLEY S L, LYNNE A M. Food animal-associated Salmonella challenges:Pathogenicity and antimicrobial resistance[J]. Journal of Animal Science,2008, 86(14): 173-186.

[2] BOSILEVAC J M, GUERINI M N, KALCHAYANAND N, et al. Prevalence and characterization of Salmonellae in commercial ground beef in the United States[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009,75(7): 1892-1900.

[3] ALTEKRUSE S F, BAUER N, CHANLONGBUTRA A, et al. Salmonella enteritidis in broiler chickens, United States, 2000－2005[J].Emerging Infectious Diseases, 2006, 12(12): 1848-1852.

[4] HERNANDEZ T, SIERRA A, RODRIGUEZ A C, et al. Salmonella enterica serotypes isolated from imported frozen chicken meat in the Canary islands[J]. Jounal Food Protect, 2005, 68(12): 2702-2706.

[5] CAPITA R, ALONSO-CALLEJA C, PRIETO M. Prevalence of Salmonella enterica serovars and genovars from chicken carcasses in slaughterhouses in Spain[J]. Journal of Applied Microbiology, 2007, 103(5):1366-1375.

[6] GONCAGUL G, GUNAYDIN E, CARLI KT. Prevalence of Salmonella serogroups in chicken meat[J]. Turkey Journal of Veterinary Animal Science, 2005, 29: 103-106.

[7] 丁孟建, 高继业, 唐妤, 等. 肉鸡源肠炎沙门氏菌的分离与鉴定及生物学特性观[J]. 中国畜牧兽医, 2009, 36(5): 203-205.

[8] 黄素珍, 杜元钊, 张艳红. 检测肠炎沙门氏菌ELISA方法的建立与应用研究[J]. 中国预防兽医学报, 2006, 28(2): 196-200.

[9] 奥斯伯F M, 布伦特R, 金斯顿R E, 等. 精编分子生物学实验指南[M]. 颜子颖, 王海林, 译. 北京: 科学出版社, 1999: 704.

[10] PAN Tzuming, LIU Yiju. Indentification of Salmonella enteritidis isolates by polymerase chain reaction and multiplex polymerase chain reaction[J]. Journal Microbiology Immunology Infection, 2002, 35(2):147-151.

[11] SZABO E A, MACKEY B M. Detection of Salmonella enteritidis by reverse transcription-polymerase chain reaction (PCR)[J]. International Journal of Food Microbiology, 1999, 51(1): 113-122.

[12] 刘秀梵. 兽医流行病学[M]. 2版. 北京: 中国农业出版社, 2000: 121-129.

[13] VANESSA S, EDWARD T M, MICHAEL B. A comparison of standard cultural methods for the detection of foodborne Salmonella species including three new chromogenic plating media[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 123(1): 61-66.

[14] 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所. GB/T 4789.4—2008 食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[15] OLIVEIRA S D, SANTOS L R, SCHUCH D M T, et al. Detection and dentification of Salmonellas from poultry-related samples by PCR[J].Veterinary Microbiology, 2002, 87(1): 25-35.

[16] 李慧, 张会彦, 马晓燕, 等. 改良FTA-PCR 快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的研究[J]. 食品科学, 2009, 30(6): 196-198.

[17] WOODWARD M J, KIRWAN S E S. Detection of Salmonella enteritidis in eggs by the polymerase chain reaction[J]. Veterinary Record,1996, 138: 411-413.

[18] QUESSY S. Control of Salmonella from farm to the table[C]//Eastern Nutrition Conference, Quebec City, Canada, May 8-9, 2003.

[19] HEYNDRICKX M, VANDEKERCHOVE D, HERMAN L, et al. Routes for Salmonella contamination of poultry meat: epidemiological study from hatchery to slaughterhouse[J]. Epidemiology Infection, 2002, 129:253-265.

[20] HOLT P S, GEDEN C H, MOORE R W, et al. Isolation of Salmonella enterica serovar Enteritidis from houseflies (Musca domestica) found in rooms containing Salmonella serovar Enteritidis-challenged hens[J].Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(19): 6030-6035.

[21] SADEYEN J R, TROTEREAU J, VELGE P, et al. Salmonella carrier state in chicken: comparison of expression susceptible and resistant animal[J]. Microbes and Infection, 2004, 14(6): 1278-1286.

Contamination Pathways of Raw Chicken by Salmonella enteritidis in Slaughterhouses

LI Ji-xiang，GAO Ji-ye，TANG Yu，DING Meng-jian，ZHU Zhou-fu
(Rongchang Campus, Southwest University, Chongqing 402460, China)

2009-12-24

重庆市自然科学基金项目(CSTC，2008BB1245)；西南大学科技服务资助项目(2007F002)

李继祥(1968—)，男，副教授，博士，研究方向为动物疫病与兽医公共卫生。E-mail：jxianglucky@126.com