油菜蜂花粉ACE抑制活性水解物的制备及分离

李天娇，徐 响,2，孙丽萍,2,*，董 捷,2

(1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2.国家农产品加工技术研发中心蜂产品分中心，北京 100093)

油菜蜂花粉ACE抑制活性水解物的制备及分离

李天娇1，徐 响1,2，孙丽萍1,2,*，董 捷1,2

(1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2.国家农产品加工技术研发中心蜂产品分中心，北京 100093)

采用4种蛋白酶水解油菜蜂花粉蛋白制备ACE抑制活性物质，高效液相色谱法测定油菜蜂花粉蛋白水解物对ACE的抑制率。结果表明：油菜蜂花粉蛋白酶水解物具有ACE抑制活性，水解物对ACE的抑制活性差异显著(P＜0.05)，其中碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞酸性蛋白酶，碱性蛋白酶水解物的IC50为0.35mg/mL。4种蛋白酶水解物经Bio P-2凝胶分离后，ACE抑制活性较强的组分主要集中在保留时间70～120min，在此区间碱性蛋白酶水解物分离组分对ACE的抑制率达到90%以上，分子质量在376.4～1355D之间。

油菜蜂花粉蛋白；蛋白酶水解物；ACE抑制活性

Abstract：Four kinds of proteases were used for rape bee pollen protein enzymolysis to prepare ACE inhibitory activity hydrolysates. The ACE inhibitory activity (IC50) of enzymatic hydrolysates was determined by HPLC method. The results indicated that four hydrolysates prepared with different proteases had significantly different ACE inhibitory activities (P＜0.05). The strongest ACE inhibitory activity was observed in alkaline protease derived hydrolysate, with an IC50of 0.35 mg/mL, followed by neutral protease, papain and acid protease derived hydrolysates. Furthermore, four rape bee pollen protein hydrolysates were applied to a Bio P-2 gel column for fractionization. Fractions with a retention time ranging from 70 to 120 min presented stronger ACE inhibitory activity and statistical analysis showed that their ACE inhibition inhibitory ratios were significantly different (P＜0.05). All of the corresponding fractions separated from alkaline protease derived hydrolysate had more than 90%ACE inhibitory ratio, and their molecular weight distribution varied from 376.4 to 1355 D.

Key words：rape bee pollen protein；protease hydrolysates；ACE inhibitory activity

目前，全球高血压患者已突破10亿，我国高血压患病人数近2亿，且每年新增高血压患者在1000万人以上[1]。由于ACEⅠ(血管紧张素转化酶抑制剂)适用于不同程度及年龄的高血压病人，是常用的降压药物，但是会导致高钾血症、可逆性肾损害、咳嗽等副作用和停药后血压反跳性升高的药物依赖作用[2]。来源于食物的ACE(血管紧张素转化酶)抑制肽安全性高，除了可以克服药物治疗中出现的不良反应和依赖作用，还具有众多的生理活性，如抗氧化、降胆固醇、抗疲劳、促进乙醇代谢等活性[3-5]。

蜂花粉是蜜蜂采集植物的精细胞加上自身腺体分泌物、唾液和蜂蜜混合而形成，蛋白质平均含量为20%，富含与降血压作用相关的芳香族氨基酸和疏水性氨基酸[6]。本实验采用蛋白酶水解蜂花粉蛋白质，制备具有ACE抑制活性的蛋白酶水解物，为蜂花粉功能食品开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

油菜蜂花粉蛋白 本实验室自制。

血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酸(hippuric acid)、马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL) Sigma公司；Bio P-2凝胶Bio-Rad公司；碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 北京奥博星生物技术责任有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

SY-3003B发酵罐 上海世远生物设备工程有限公司；LP731-8300全自动生物层析仪 Bio-Rad公司；GJ-18S立式冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；Seven Easy型pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；HZS-H水浴振荡器 哈尔滨市东明医疗仪器公司。

1.2 油菜蜂花粉蛋白酶水解物的制备

油菜蜂花粉蛋白质量浓度5g/100mL，4种蛋白酶用量均为1g/100mL，加入盐酸或氢氧化钠溶液稳定pH值，酸性蛋白酶稳定pH4.0，木瓜蛋白酶稳定pH6.01，中性蛋白酶稳定pH7.04，碱性蛋白酶稳定pH9.03，50℃、水解80min，然后经沸水浴灭酶，冷却至室温，5000r/min离心10min，上清液冷冻干燥，－20℃保藏。

1.3 油菜蜂花粉蛋白酶水解物中蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝法[7]测定油菜蜂花粉蛋白水解物的蛋白含量。

1.4 油菜蜂花粉蛋白酶水解物对ACE的抑制作用

HPLC法测定油菜蜂花粉蛋白酶水解物对ACE的抑制作用，参照文献[8]略有修改，20μL HHL(2mg/mL)、20μL水解物、2.5μL 0.1U/mL ACE，37℃反应30min，加1mol/L HCl溶液 42.5μL，进样70μL，228nm波长处检测产物马尿酸(HIP)峰面积，根据公式(1)计算抑制率。

式中：IP为蛋白酶水解物对ACE的抑制率；A1为不加蛋白酶水解物马尿酸的峰面积；A0为加入蛋白酶水解物后马尿酸的峰面积。

1.5 油菜蜂花粉蛋白酶水解物的分离

油菜蜂花粉蛋白酶水解物应用Bio P-2凝胶(1.5cm×30cm)层析分离，流速0.5mL/min，蛋白酶水解物10mg/mL，上样量1mL，每10min收集一个组分，各分离组分冷冻干燥，按1.4节方法测定ACE抑制率。

1.6 油菜蜂花粉蛋白酶水解物分子质量范围的测定

选用VB12(MW1355D)、氧化型谷胱甘肽(MW612.6D)，VB2(MW376.4D)作为标准物质，按上述层析分离条件进行层析，测定油菜蜂花粉蛋白酶水解物的分子质量分布范围。

1.7 统计分析

2 结果与分析

2.1 油菜蜂花粉蛋白酶水解物的制备及其对ACE的抑制作用

表1 油菜蜂花粉蛋白酶水解物蛋白质含量和对ACE的抑制活性Table 1 Protein content and ACE inhibitory activity (IC50) of four rape bee pollen protein hydrolysates prepared with different proteases

IC50即为抑制率达到50%时所需的酶水解物质量浓度。IC50评价水解物对ACE抑制活性，IC50越小，说明ACE抑制活性越大。由表1可知，蜂花粉蛋白经过4种蛋白酶水解，水解物得率均在30%左右。碱性蛋白酶水解物ACE抑制活性最大，IC50为0.35mg/mL。而酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解物ACE抑制活性与碱性蛋白酶水解物ACE抑制活性差异显著(P＜0.05)。碱性蛋白酶水解物的蛋白含量最低，只有56.97%，与其他蛋白酶水解物蛋白含量差异显著(P＜0.05)。水解物的蛋白含量越低，说明水解作用越强，产生的肽越多。

油菜蜂花粉蛋白4种水解物的蛋白含量和ACE抑制活性均有显著差异(P＜0.05)，这是由于蛋白酶的性质造成的，酸性蛋白酶的作用位点为苯丙氨酸、亮氨酸[9]；木瓜蛋白酶的作用位点为精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸[10]；中性蛋白酶的作用位点为精氨酸、赖氨酸、酪氨酸[11]；碱性蛋白酶的作用位点为丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸[12]。而且油菜蜂花粉中氨基酸含量丰富，其中丙氨酸1.737g/100g、缬氨酸1.289g/100g、亮氨酸1.696g/100g、酪氨酸0.882g/100g、苯丙氨酸1.023g/100g、赖氨酸1.776g/100g、精氨酸1.130g/100g[13]。由于蛋白酶作用位点不同和油菜蜂花粉中氨基酸丰富，不同蛋白酶水解蜂花粉蛋白得到的水解物中蛋白含量和种类不同。碱性蛋白酶水解物的蛋白含量最低，与其他蛋白酶水解物蛋白含量有显著差异，可能是由于碱性蛋白酶作用位点宽泛，油菜蜂花粉蛋白更容易与碱性蛋白酶作用，生成了更多的活性肽所致。因此，碱性蛋白酶水解蛋白含量最低，ACE抑制活性更强。

Cheung等[14]认为ACE抑制肽的活性主要取决于C端氨基酸，C端氨基酸为芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)时，其ACE抑制活性较高。另外，N端氨基酸为疏水性氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)或碱性氨基酸的肽与ACE的亲和力较大，ACE抑制活性较强。油菜蜂花粉蛋白碱性蛋白酶水解物可能富含与ACE抑制活性相关的芳香族氨基酸和疏水性氨基酸。

2.2 油菜蜂花粉蛋白水解物的分离及其对ACE的抑制作用

油菜蜂花粉蛋白水解物经过Bio P-2凝胶分离，测定质量浓度为0.5mg/mL分离组分的ACE抑制率，结果见图1。

图1 油菜蜂花粉蛋白水解物Bio P-2凝胶层析图谱及分离组分对ACE的抑制率Fig.1 Bio P-2 gel filtration chromatographic fractionization of four rape bee pollen protein hydrolysates prepared with different proteases

如图1所示，ACE抑制活性较强的组分主要集中在70～120min，其对应组分的分子质量在376.4～1355D之间。样品质量浓度为0.5mg/mL时，4种水解物分离组分ACE抑制率存在显著差异(P＜0.05)，碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞酸性蛋白酶，碱性蛋白酶水解物分离组分ACE抑制率最大，达到90%以上。酸性蛋白酶水解物80～100min组分ACE抑制率达到90%，其他组分ACE抑制率在40%左右。木瓜蛋白酶水解物40～70min和70～130min组分，ACE抑制率随着肽的分子质量的减小而上升，ACE最大抑制率为80%。中性蛋白酶水解物组分对ACE最大抑制率仅为70%。碱性蛋白酶水解物ACE抑制肽主要分布在70～120min，ACE抑制率达到90%以上。

尽管肽的分子质量相同，其氨基酸序列不同，ACE抑制活性也会不同[15]。Tovar-Perez等[16]研究发现，碱性蛋白酶作用位点比较宽泛，生成大量C端为酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸的肽，这些C端氨基酸基团在竞争结合ACE活性位点时起着重要的作用。Matsui等[17]发现，大多数ACE抑制肽在二肽和十肽之间。刘佳[18]以大豆为原料，得到ACE抑制肽为二肽，氨基酸序列为Ser-Trp，IC50为41.1μmol/L。辛志宏等[19]得到小麦ACE抑制肽为三肽，氨基酸序列可能为Ala-Met-Tyr，IC50为5.46μmol/L。Ma等[20]分离荞麦ACE抑制肽为三肽，氨基酸序列为Gly-Pro-Pro，IC50为6.25μg/mL。本实验中，碱性蛋白酶水解物ACE抑制肽的分子质量在376.4～1355D之间，且具有较强的ACE抑制活性，其氨基酸组成和结构有待进一步深入研究。

3 结 论

本实验应用蛋白酶水解油菜蜂花粉蛋白，制备出具有ACE抑制活性的蛋白质水解物，其中碱性蛋白酶水解物对ACE的抑制活性最高，IC50值达到0.35mg/mL，经过Bio P-2凝胶分离，保留时间在70～120min之间的组分(质量浓度0.5mg/mL)对ACE的平均抑制率高达90%以上，分子质量在376.4～1355D之间。由此可见，从油菜蜂花粉蛋白的碱性蛋白酶水解物中筛选ACE抑制剂，是开发油菜花粉功能食品的一条新途径。

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Preparation and Separation of ACE Inhibitory Hydrolysates from Rape Bee Pollen

LI Tian-jiao1，XU Xiang1,2，SUN Li-ping1,2,*，DONG Jie1,2
(1. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. Branch Center of Bee Production, National R&D Center for Agro-Food Processing, Beijing 100093, China)

Q503；S896.4

A

1002-6630(2010)15-0163-04

2010-05-27

农业部公益性行业(农业)科研专项经费(nyhyzx07-041)；农业部现代农业蜂产业技术体系建设专项资金(NYCYTX-43)；中国农业科学院科研经费项目

李天娇(1984—)，男，硕士研究生，研究方向为蜂产品化学。E-mail：litianjiao2008@yahoo.com.cn

*通信作者：孙丽萍(1963—)，女，研究员，硕士，研究方向为蜂产品功能因子的分离与纯化。E-mail：caasun@126.com