云南种植玛咖乙醇提取物的体外抗氧化活性分析

何 钊，冯 颖*，徐珑峰，孙 龙，石 雷，陈晓鸣，张忠和

(中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室，云南 昆明 650224)

云南种植玛咖乙醇提取物的体外抗氧化活性分析

何 钊，冯 颖*，徐珑峰，孙 龙，石 雷，陈晓鸣，张忠和

(中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室，云南 昆明 650224)

采用铁离子还原能力(FRAP)、Fenton反应体系、DPPH法及邻苯三酚自氧化体系评价种植于云南的玛咖乙醇提取物体外抗氧化能力。结果表明：在云南种植的3种颜色玛咖乙醇提取物均表现出抗氧化活性，且呈现一定的量效关系，但在4种抗氧化体系中的结果有所不同；紫色玛咖的总还原能力最强，黄色次之，白色最弱，3200m海拔地区种植的玛咖高于其他相对低海拔地区的玛咖；紫色和黄色玛咖的清除DPPH自由基能力高于白色，3200m海拔地区种植的玛咖高于其他相对低海拔地区的玛咖；3种颜色玛咖对羟自由基的清除能力明显，各样品的清除率在加入量为200μL时均达到90%以上，3000m海拔地区种植的黄色玛咖最强；3种颜色玛咖对超氧阴离子自由基的清除能力在实验范围内均较弱。

玛咖；颜色；抗氧化；自由基

Abstract ：The total antioxidant activity (TAC) of ethanol extracts of different color types (white, yellow and purple) of maca(Lepidium meyenii Walpers) cultivated at different altitude areas (2000, 2500, 3000 m and 3200 m) in Yunnan was measured by ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay. Also, their scavenging activities against hydroxyl free radicals generated from Fenton reaction, DPPH free radicals and superoxide anion free radicals by a pyrogallol autooxidation system were evaluated. The results indicated that ethanol extracts of 3 color types of maca cultivated in Yunnan all had dose-dependent total antioxidant and free radical scavenging effects. Purple maca presented the highest TAC, followed by yellow and white macas. The DPPH free radical scavenging activity of white maca was lower than those of other two color types of maca. A higher TAC and a higher DPPH free radical scavenging activity were both observed in maca cultivated at 3200 m-altitude area than that from lower altitude areas. Three color types of maca were all able to remarkably scavenge hydroxyl radicals, with a scavenging ratio of more than 90% at a dose of 200 μL and yellow maca cultivated at 3000 m-altitude area had the best hydroxyl free radical scavenging activity. Three color types of maca all had only weak scavenging effect on superoxide anion free radicals.

Kew words：maca (Lepidium meyenii Walpers)；color type；antioxidation；free radicals

玛咖(Lepidium meyenii Walpers)是原产于秘鲁海拔3500m以上安第斯高寒山区的草本植物，属十字花科独行菜属[1]。玛咖的栽培和食用历史悠久，在南美地区，当地人主要将其作为食物，也作为传统药物使用，具有抗疲劳、改善性功能、提高生育力等多种功效[2]。近年来，玛咖的独特功效引起了研究者的关注。研究发现玛咖除含有多种营养成分外[3]，还含有玛咖酰胺、玛咖烯、芥子油苷及其衍生物、固醇等多种活性物质[2-5]。动物实验和人体实验研究表明，玛咖具有抗疲劳[6-7]、改善性功能[8-11]、减少前列腺增生[12]、提高生育能力[13]等多种功效，且无毒、食用安全[14]。Sandoval等[15]用ONOO－、DPPH自由基、H2O2以及去氧核糖降解的抑制作用来评价玛咖的水提液抗氧化作用，实验结果表明，玛咖具有清除自由基的能力以及保护细胞DNA、对抗氧化压力的功效，作者推测可能是玛咖水提物中芥子油苷及其分解产生的异硫氰酸酯类物质发挥作用；此外，通过比较玛咖正己烷提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物及甲醇提取物对DPPH自由基清除作用[16]，发现只有甲醇提取物可以明显抑制DPPH自由基，表现出抗氧化活性，因此认为玛咖中的极性成分具有抗氧化作用。

对栽培于云南的玛咖进行营养成分分析表明，引种玛咖与秘鲁产玛咖在营养成分指标上类似[17]。本研究在此基础上对云南引种栽培玛咖的乙醇提物进行体外抗氧化实验，以期为云南栽培玛咖的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

根据表皮颜色，分别采集种植于云南省乌蒙山区4个不同海拔地区(2000、2500、3000、3200m)的白色、黄色及紫色3个类型的玛咖块根，自然晒干后每种随机取样1kg，粉碎后过60目筛，4℃冷藏备用。

二苯代苦味肼基(DPPH)、三吡啶三吖嗪(tripyridyltriazine，TPTZ) Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DU800紫外-可见分光光度计 美国贝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 玛咖乙醇提取液的制备

称取各粉碎后的玛咖样品20g，加入体积分数75%乙醇200mL，室温下超声提取30min，过滤后滤渣再加200mL 75%乙醇提取，共提取3次，合并滤液后减压浓缩，75%乙醇定容到100mL，0.45μm滤膜过滤后备用。

1.3.2 玛咖乙醇提取物总还原能力测定

采用铁离子总还原/抗氧化方法(FRAP法)[18]。FRAP试剂：10mmol/L的TPTZ(用40mmol/L 盐酸溶解)、20mmol/L的FeCl3·6H2O和pH3.6的乙酸缓冲液以1:1:10的体积比混匀，在37℃保温备用。

标准曲线的绘制：分别吸取0.1mL不同浓度的FeSO4溶液，各加入3.9mL FRAP试剂，混匀后37℃反应10min，测定593nm波长处吸光度。以吸光度为纵坐标，FeSO4浓度为横坐标，绘制标准曲线。

样品测定：0.1mL样品中加入3.9mL FRAP试剂，混匀后37℃反应10min，593nm波长处测定吸光度，以去离子水作为空白对照，样品还原能力以达到同样吸光度所需的FeSO4的浓度表示。

1.3.3 玛咖乙醇提取物清除DPPH自由基能力测定

0.4 mmol/L DPPH自由基乙醇溶液3.9mL与不同体积(10～80μL)的样品混和，75%乙醇补充至4.0mL，充分混和后在暗处静置30min，517nm波长处测定其吸光度。

式中：Ai为样品与DPPH自由基反应后体系的吸光度；Aj为样品本身吸光度(以3.9mL乙醇替代DPPH自由基)；A0为未加样品空白值(以0.1mL 75%乙醇替代样品)的吸光度[15]。根据清除率与加入样品体积的关系，计算出自由基清除率为50%时样品的剂量(IC50)，IC50值反映样品对自由基的清除能力，IC50值越小，表明样品清除自由基的能力越强。

1.3.4 玛咖乙醇提取物清除羟自由基(·OH)能力测定

采用Fenton反应体系[19-20]。10mL试管中依次加入0.5mL 9mmol/L FeSO4、0.5mL 9mmol/L水杨酸-乙醇溶液及不同体积样品溶液(50～200μL)，0.01mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.4)补充至5mL，最后加0.5mL 8.8mmol/L H2O2启动反应，37℃水浴反应30min，在510nm波长处测量各浓度的吸光度。

式中：A0为未加样品(以75%乙醇代替样品)的空白对照液吸光度；Ai为加入玛咖乙醇提取物后反应体系的吸光度；Aj为不加H2O2的玛咖乙醇提取物(以蒸馏水代替H2O2)本底的吸光度。

1.4 数据处理

所有实验设3次重复，数据处理采用Excel 2003处理，结果采用±s表示。

2 结果与分析

2.1 玛咖乙醇提取物总还原能力

图1 玛咖乙醇提取物铁离子总还原能力Fig.1 Total antioxidant activity of ethanol extracts of different color types of maca

总还原力FRAP值越大，表明抗氧化剂的还原能力越强，抗氧化活性越高[22]。由图1的FRAP值可见，不同颜色玛咖均具有抗氧化活性，但其还原能力有一定差异。除3000m海拔处黄色玛咖提取物还原力略高于紫色外，其余海拔条件下种植的玛咖提取物的还原能力均为紫色＞黄色＞白色。3种颜色玛咖的总还原能力均为海拔3200m种植的样品最强，白色和黄色玛咖乙醇提取物的总还原能力随种植地海拔的升高而增强；紫色玛咖乙醇提取物除3000m外，其余样品的总还原能力也随种植地海拔的升高而增强。

2.2 玛咖乙醇提取物清除DPPH自由基能力

DPPH自由基方法操作简便且灵敏度高，在天然抗氧化物研究中应用较为普遍[22]。由表1可知，不同颜色玛咖的乙醇提取物均具有清除DPPH自由基的能力，清除率随剂量的增加而增强，具有一定量效关系。不同海拔种植的白色玛咖提取物对DPPH自由基清除率达到大于80%时的剂量分别为80μL(2000m)、60μL(2500m和3000m)及40μL(3200m)；黄色、紫色玛咖提取物对DPPH自由基清除率达到大于80%时的剂量分别为60μL(2000m和2500m)及40μL(3000m和3200m)，可见3种颜色玛咖提取物具有随种植地海拔增高而清除DPPH自由基的能力增强的趋势。

图2 玛咖乙醇提取物清除DPPH自由基能力的IC50值Fig.2 IC50of ethanol extracts of different color types of maca for scavenging DPPH free radicals

由图2可知，随着种植地海拔的增高，3种颜色玛咖的IC50值总体上呈下降趋势，清除DPPH自由基的能力逐渐增强；相同海拔条件的黄色和紫色玛咖的IC50值低于白色玛咖，表明黄色和紫色玛咖清除DPPH自由基的能力较强。

2.3 玛咖乙醇提取物清除·OH能力

图3 玛咖乙醇提取物清除·OH的IC50值Fig.3 IC50of ethanol extracts of different color types of maca for scavenging hydroxyl free radicals

表1 玛咖乙醇提取物对DPPH自由基抑制率的影响Table 1 Scavenging effects of ethanol extracts of different color types of maca on DPPH free radicals

表2 玛咖乙醇提取物对·OH抑制率Table 2 Scavenging effects of ethanol extracts of different color types of maca on hydroxyl free radicals

表3 玛咖乙醇提取物清除O－2·能力Table 3 Scavenging effects of ethanol extracts of different color types of maca for scavenging superoxide ion free radicals

羟自由基是人体中最活泼、对机体危害最大的自由基[23]。由表2可见，4种海拔条件下3种颜色的玛咖提取物清除·OH的能力均较强，且随剂量的增加而增强，当剂量为200μL时，各种颜色玛咖提取物对·OH清除率均达到90%以上，其中2500m处种植的紫色玛咖在剂量为175μL时其抑制率达到91.68%，清除能力最好。

由图3可见，3000m海拔地区种植的黄色玛咖IC50值最低；2000m和2500m海拔的紫色玛咖的IC50值低于白色和黄色玛咖；而3000m和3200m的黄色玛咖的IC50值低于其他2种颜色玛咖，但差别不明显。结果表明3种颜色的玛咖提取物清除·OH的能力差别不大。

2.4 玛咖乙醇提取物清除O·能力

3 讨 论

本实验采用FRAP、清除羟自由基、清除DPPH自由基及清除超氧阴离子自由基4种方法对云南引种玛咖样品的乙醇提取物进行体外抗氧化实验结果表明，云南种植的3种颜色玛咖均表现出抗氧化活性，且具有量效关系，抗氧化能力随样品剂量的增加而增强。对不同的抗氧化体系，3种颜色玛咖抗氧化能力存在一定差别。紫色玛咖总还原能力最强，黄色次之，白色最弱；紫色和黄色玛咖清除DPPH自由基能力高于白色；3种颜色玛咖对羟自由基的清除能力明显。研究结果说明在云南不同地区种植的3种颜色玛咖与原产秘鲁的玛咖一样具有抗氧化生物活性，表明在云南不同地区具有发展玛咖种植产业的条件。

Sandoval等[15]、Leea[16]等的研究结果证实玛咖水、甲醇提取物具有抗氧化活性，但其实验中未涉及不同颜色玛咖的抗氧化活性比较。Gonzales[24]、Gasco[25]等通过喂养玛咖对小鼠日精子量等方面影响的研究，比较了红色、黑色和黄色玛咖水提物的生物活性，发现3种颜色的玛咖在生物活性的表现上存在差异。本研究发现不同颜色的玛咖在不同氧化体系中表现出一定的抗氧化能力差异，进一步证实不同颜色的玛咖生物活性存在一定差异。不同颜色玛咖抗氧化活性的差异，表明其活性成分可能有所不同，引起活性差异的具体成分待进一步分析确定。从抗氧化能力考虑黄色和紫色玛咖要优于白色玛咖，可以优先考虑在云南地区种植黄色和紫色玛咖。

玛咖原产地是秘鲁3500m以上安第斯高寒山区，属高山植物[26]。海拔的变化可引起土壤、光照、温度、水质、雨量等植物生长的相关生态因子的变化[27]，对分布于不同产地或海拔高度的同种植物体内次生代谢产物产生存在一定的影响[28]。刘雷等[27]对峨眉山不同海拔和山峪鱼腥草的挥发油成分进行分析，发现不同山峪及海拔高度对各鱼腥草挥发油成分和含量具有显著性影响。汪晓峰等[29]比较了四裂红景天和长鳞红景天叶片中抗氧化系统随海拔梯度的变化，发现红景天内抗氧化保护酶的活性及含量随海拔升高有不同程度的提高。本研究发现玛咖的体外抗氧化活性与其种植的海拔具有一定的关系，推测海拔变化伴随着玛咖生长环境的改变，有可能造成玛咖体内一些与抗氧化活性相关的物质积累的变化，从而使得其抗氧化能力出现一定的差异，对不同抗氧化体系的结果也不同。

本研究显示玛咖的乙醇提取物同水提物[15]、甲醇提取物[16]一样均具有抗氧化活性，抗氧化成分可能属于极性化合物。研究认为高等植物中存在的类黄酮多酚类等次生代谢物具有较强的自由基清除能力，对人体健康具有积极的作用[30]。玛咖乙醇提物中起抗氧化作用的物质是否属于黄酮多酚类物质还有待进一步研究确认。

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in vitro Antioxidant Activity of Ethanol Extract of Maca (Lepidium meyenii Walpers) Cultivated in Yunnan

HE Zhao，FENG Ying*，XU Long-feng，SUN Long，SHI Lei，CHEN Xiao-ming，ZHANG Zhong-he
(Key Laboratory of Breeding and Utilization of Resource Insects of State Forest Administration, Research Institute of Resource Insects of Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China)

Q949.748；TS218

A

1002-6630(2010)15-0039-05

2009-12-30

国家林业局“948”项目(2008-4-13)；中国林业科学院资源昆虫研究所基本科研业务费专项(Riri200704M)

何钊(1976—)，男，助理研究员，硕士，研究方向为天然产物。E-mail：zhe999@hotmail.com

*通信作者：冯颖(1960—)，女，研究员，博士，研究方向为药用昆虫和天然产物。E-mail：yingf@hotmail.com