REACH法规的环境影响试验法

小岛肇夫

REACH法规的环境影响试验法

小岛肇夫

REACH法规是针对化学品及其安全性的一项新技术法规，它解决化学品的出口、评估、许可和限制事宜，为化学品提供更全面的安全性数据，旨在提高化学物质对人类健康和环境的安全性。本文综述了REACH关于生物毒性、降解性及环境影响的评价内容，帮助企业加深对REACH的认识。

REACH；环境评价；OECD试验指南

REACH是欧盟对在市场流通的现有化学物质和新型化学物质实施的一项法规，它要求供应商为所提供的化学物提供有关的安全性数据，并按指定要求履行登录的义务，是注册、评价、许可、限制的总称。欧盟2007年开始提出相关要求，2008年6月开始运作，2018年6月完成年产量或进口量1吨以上化学物质的注册工作。本来，REACH只是欧盟的内部事务，但如今已成为全球性的安全性评价问题，日本从不关心此事到为整个产业界积极采取对策，可见REACH法规对日本制造业的影响之大。

1 REACH要求的安全性资料

REACH的安全性评价包括毒理性和危险性（毒性和曝露性评价）两项基本内容，2009年底进行事前登录的化学物质约有18万个，其中70%的试验将在2011～2017年实施。

表1 REACH根据制造量/进口量列出的必须实施的危险性试验方法

表1是根据制造量和进口量列出的必须实施的危险性试验方法。在该试验法中没有对少量生产物质的有害性试验，对10t以上新型化学物质的生产还要求进行曝露性的评价试验。充分掌握表1所示试验法的精髓对把握试验结果非常重要。本文将主要讨论与环境影响评价有关的试验法及其选择。

REACH的环境影响评价试验法大致分为4类：1）对水生生物的影响；2）对活性污泥呼吸的抑制作用；3）在环境中的行为和结果；4）对陆生生物的影响。表2是化学物对水生生物的主要影响试验法，超过1t的新型化学物必须进行无脊椎动物的急性毒性试验和对水生物的生长抑制试验；对于超过10t的新型化学物，还必须进行鱼类的急性毒性试验。但是，试验物质的溶解性是一项关键性指标，对溶解性低的场合，除进行急性毒性试验外，还必须进行长期的毒性试验；对100t以上的化学物质，必须进行无脊椎动物和鱼类的长期毒性试验。REACH试验法以选定生物群的生态机能为重点，从中选取感受性高的生物作为试验对象，并以OECD试验指南的方式推荐给用户。表2是OECD试验指南，表3是OECD指南收录的主要文件。

2 环境影响评价试验法概要

2.1 对水生生物的影响试验

无脊椎动物、藻类、鱼类常用作对水生生物影响的毒性试验的评价对象。急性毒性试验以能引起无脊椎动物、藻类、鱼类死亡的浓度EC（有效作用浓度）和LC（致死浓度）为指标，慢性毒性试验则以致死或成长和繁殖等指标来衡量。

表2 OECD收录的与生态有关的试验指南

表3 OECD收录的与生态有关的试验指南文件

2.1.1 用无脊椎动物进行的急性毒性试验

OECD试验指南202条推荐使用Daphnia magna（一种水蚤）作为急性游泳抑制试验对象，这是由于水蚤对化学物质的感受性较高之故。把水蚤暴露于含化学物质的水中48h后，观察水蚤的游泳状态（以在运动的容器中静止15s为限）。测定游泳试验中的半数抑制浓度时，在含不同浓度化学物质的水中放入出生时间在24h内的水蚤幼虫，24h和48h分别观察水蚤幼虫的致死量。

2.1.2 用水生生物进行生长抑制试验

OECD试验指南201条推荐以藻类为生长抑制试验对象，藻类多使用小球藻等品种（藻类寿命很短，适合在短时间内进行急性和慢性毒性评价）。试验时，通常会考察藻类在含化学物质的环境中曝露72h后，化学物对藻类生长性的影响，在含不同浓度化学物质的水中按指数函数的比例放入藻类，在光照条件下培养72h，每24h测定一次存活的藻类数，由此可得到半数生长抑制浓度（EC50）和无影响浓度（NOEC）。

2.1.3 鱼类急性毒性试验

OECD试验指南203条要求使用鱼类（推荐Oryzias latipes、斑鱼、鲤鱼、食蚊鱼、鲑鱼）进行急性毒性试验，观察化学物对鱼类生存性的影响。试验时，在含不同浓度化学物质的水中放入幼鱼（0.1～5g），96h后测定幼鱼的死亡数，测得半致死浓度LC50。

2.1.4 无脊椎动物的长期毒性试验

OECD试验指南211条要求使用水蚤作繁殖抑制性试验，观察水蚤在含化学物质的水中曝露21天后对其繁殖性的影响。这种比较简便的试验方法常被用来进行有害性评价试验。根据母水蚤的毒性症状和初次产仔日、幼虫产出数、死亡数、产仔幼体的生存和死亡数，获得半数繁殖抑制浓度EC50和无影响浓度NOEC。

2.1.5 鱼类长期毒性试验

本试验分为三项，是REACH中必须检测的项目。

1）鱼类初期生活阶段的毒性。OECD试验指南210条要求选择有代表性的受精卵孵化，在幼鱼的初期生长阶段使其曝露于含化学物质的水中，期限为30天，观察化学物质对幼鱼的慢性影响，试验时把Oryzias latipes、斑鱼、鲑鱼等鱼类的受精卵放入小槽，并与对照区的鱼卵对比，观察鱼卵的孵化数、生存数、体型异常、行动阻害、体长及体重变化，从而求出最低有影响浓度（LOEC）及NOEC。

2）对胚胎、幼鱼的短期毒性。OECD试验指南第212条规定，选择有代表性的受精卵孵化成幼鱼，考察化学物质的短期毒性。试验时，把Oryzias latipes、斑鱼、鲑鱼等的受精卵放入水槽，每种幼鱼的卵黄均被取出，对照区的幼鱼出现因饥饿死亡的现象时试验终止。测定累积死亡率、健康的幼鱼数、孵化开始的天数、孵化数、成长等项目，得出LOEC及NOEC数值。

3）幼鱼成长。OECD试验指南215条规定选取有代表性的幼鱼进行化学物质曝露试验。本试验使用鲑鱼作为试验对象，在含化学物质的水中曝露28天，测定鲑鱼的体重、成长率，从而求得LOEC与NOEC数值。

鱼类是各地区最常使用的试验动物。图1是ECVAM（欧洲动物实验代替法检验中心）的评价程序，该机构建议尽可能少地使用鱼类进行上述试验，即：第一阶段，先用水蚤和藻类进行实验，根据得到的EC值再进行第二阶段试验；第二阶段用低浓度化学物质进行有限度的试验，依据试验结果得出该化学物的LC值。此外，ECVAM还尝试用鱼类细胞进行细胞毒性，用鱼类胚胎进行鱼的活体代替试验。

图1 ECVAM推荐的环境毒性评价程序

2.2 活性污泥呼吸抑制试验

应用活性污泥作基体，观察污泥在不同浓度的化学物质下的呼吸率（喜氧性污泥对废水中微生物的消耗量），从而评价化学物质对微生物的影响。试验中选用污水处理厂的活性污泥，测定30min和3h后的氧消耗量，确定化学物质的半数呼吸抑制浓度（EC50）。生物分解性试验（OECD指南301A-F）中，以相当于EC50的1/10的浓度考察化学物质对活性污泥的影响，其中生物分解性试验中的浓度参照活性污泥呼吸抑制试验中的NOEC值确定。

2.3 在环境中的行为和结果

化学物质在环境中的分解性、蓄积性等环境命运性数据，除了化学物质的长期环境影响评价外，PBT（持续生物累积与有毒化学物质）/vPvB（最大持久和生物累积）的评价同样重要。加水分解试验是反映非生物分解的方法，化学物质的生物分解性则可从易分解性试验与生物浓缩度试验进行考察。

2.3.1 加水分解试验

为了得到化学物质非生物分解性的相关信息，本试验将化学物质在环境表层水中的残留状况及其影响作为判断的依据。加水分解试验与pH有关，OECD指南111条规定了化学物质在指定缓冲液（pH）下的加水分解测定方法。预备试验：在50℃、pH4、7、9反应5天，如果化学物质的分解性＜10%，则认为该化学物质是稳定的；如果分解性＞10%，则在0～40℃、pH4、7、9条件下，选择合适温度再次进行类似试验，确认其稳定性。

2.3.2 易分解性试验

OECD指南第301条规定了易分解化学物质的筛选试验方法，相关试验包括：A）Doc Die-Awauy试验；B）CO2发生试验；C）改进的MITI试验；D）闭瓶试验；E）改进的OECD筛选试验；F）测压呼吸试验。在DOC试验中，经过28天曝露后，如果该化学物质的分解率＞70%，则认为它易于降解。这是因为，BOD试验中将理论分解率最高估设为60%，超过此值则判定该化学物易于分解。

2.3.3 浓缩度试验

OECD指南第305条推荐用鱼类考察化学物质在生物体内的浓缩度。在流动水的条件下，以不少于两种浓度（根据鱼类急性毒性试验得到的LC50值的1/100～1/ 10000选择2种尽可能低的浓度）曝露28天，依据测定的数值求出化学物质在鱼体内的浓缩倍率。

2.4 对陆生生物的影响

OECD指南第218和219条规定采用摇蚊毒性试验，评价化学物对底层生物的影响。试验是在底质中添加化学物质后，把Chironomus Yoshimatsui（摇蚊的一种）卵化后一岁的幼虫置于底质中，当幼虫出现羽化时，测定化学物质对幼虫成长及羽化率的影响。

化学物质对鸟类的影响，则是依据OECD指南第206条规定，以适量的化学物质投食母鸟与雏鸟，进而考察化学物质对鸟类繁殖性的影响。试验推荐选用鸭、科林鹌鹑、鹌鹑中的1种以上鸟类，根据死亡率、中毒性、母鸟雏鸟体重、摄饵量确定LOEC与NOEC值。

2.5 其他

土壤对化学物质的吸附试验：对10t以上的化学物质，依据吸附/脱附筛选试验（OECD指南121高速液相色谱法测定的土壤吸附系数）进行；对100t以上的化学物质，依据吸附/脱附追加试验（OECD指南106：批量反应平衡吸附/脱附法）实施。对100t以上的化学物质，还需进行在表层水中的最终分解试验（OECD指南309）、土壤模拟试验（OECD指南308）和底质模拟试验（OECD指南307）三项试验。

3 总结

REACH法规名义上是一项针对化学物质环境安全性的规定，实际上它还是化学品的环境准入门槛。日本环境省和国立环境研究所对OECD试验法的确立给予了大力支持，以下几项试验是国立环境研究所对OECD试验法作出的贡献：①21天的鱼类筛选试验；②用水蚤为试验对象的试验方法；③用鱼类培养细胞进行试管内试验法汇总；④协同REACH对两生类动物研讨。作为欧盟以外的国家，日本充分把握与自身出口产品相关的REACH动向，以帮助本国企业快速应对REACH的影响。

岳霄编译自日本FRAGRANCE JOURNAL，2009.8