水葫芦内生细菌脂肪酸生物标记特性研究

蓝江林，刘波，朱育菁，林营志，葛慈斌，刘芸

福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州350003

水葫芦内生细菌脂肪酸生物标记特性研究

蓝江林，刘波*，朱育菁，林营志，葛慈斌，刘芸

福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州350003

应用基于微生物细胞脂肪酸成分鉴定的全自动微生物鉴定系统，鉴定水葫芦内生细菌25株，分属15个属.共检测到27个脂肪酸生物标记（PLFAs），这些生物标记分为4种类型，即（1）高频次分布：在25株细菌中出现13～22次，属于细菌总体类群（general）的生物标记.（2）中频次分布：在25株细菌中出现5～7次，可以用于代表细菌属类群（genus）识别生物标记.（3）低频次分布：在细菌中的分布概率较小，可以用于指示特定细菌种间差异的生物标记.（4）微频次分布：仅在一种细菌种类出现，是细菌种（species）特征生物标记.利用脂肪酸生物标记分析同属细菌不同种的差异，可将微杆菌属分为2类，第1类包括菌株9Microbacterium barkeri和11Microbacterium imperiale，这两个菌株 17:0 ISO 和 14：0 ISO 的脂肪酸生物标记含量均为 0.第2类包括 10Microbacterium esteraromaticum、12Microbacterium lacticum和13Microbacterium liquefaciens，这3个菌株均含有17：0 ISO脂肪酸生物标记而区别于第一类菌株.利用脂肪酸生物标记的差异对25株内生细菌进行聚类分析，可将水葫芦内生细菌类群分为4类.不同植物内生菌群落中存在着特异的生物标记，利用特征脂肪酸生物标记的分析方法，分析水葫芦内生细菌的群体特性，对于植物内生菌微生物群落的研究具有重要意义.

内生细菌；脂肪酸生物标记；聚类分析

Received 23 May 2009 accepted 15 July 2009

Abstract：The present paper dealt with isolation and identification of the endophyte bacteria from Eichhornia crassipe（Mart.）Solms.as well as characteristics of their PLFA biomarkers.Results showed that 25 species of endophyte bacteria were identified by means of microbe identification system（MIDI system from USA）.There were 27 PLFA biomarkers detected in 25 species of endophyte bacteria,in which based on the distribution frequency in the bacteria 4 types were clustered e.g.（1）high frequency related to characteristics of microbe in general,（2）middle frequency related to bacteria in general,（3）low frequency related bacterial genus,（4）tiny frequency related to species.According to PLFAs biomarkers, 5speciesofgenusMicrobacterium weredivided into 2 groups,thegroups1 included Microbacterium barkeriand Microbacterium imperiale,there were no biomarker of 17：0 ISO and 14：0 ISO.The groups 2 included Microbacterium esteraromaticum,Microbacterium lacticum and Microbacterium liquefaciens with 17：0 ISO biomarker higher than 1.85%. Using the cluster analysis method the 25 species were classified into 4 groups based on the PLFAs biomarkers.The characteristics of the groups were discussed.There were the specific biomarker represented the endiophyte bacterica which also isolated from other plants.The research provided the analysis pattern to treat the PLFA biomarkers and analyse group characteristics of endophyte bacteria to clear the community structure of endophyte bacteria in Eichhornia crassipe（Mart.）Solms.

Keywords：endophyte bacteria；PLFAs biomarkers；cluster analysis

1 引言（Introduction）

水葫芦（Eichhornia crassipe（Mart.）Solms）又名凤眼莲，属单子叶多年生植物，雨久花科，凤眼兰属，可进行有性和无性繁殖，在南方大部分地区可周年发生，是世界上繁殖最快的水草之一（段惠等，2003）.目前，已在南方诸多水域泛滥成灾，国内外许多科研工作者正尝试各种方法进行防除，但都难以达到彻底根除的效果.

植物内生细菌（Endophyte bacteria）是指能在健康植物组织内栖居而对植物不造成实质性危害而与植物建立了和谐联合（Compatible association）关系的微生物（Di Fiore and Del Gallo,1995）.在宿主的影响下，内生菌的不同亚群会在不同的环境中形成，当宿主植物在环境恶化的情况下，它会选择那些增强其抵抗恶劣环境的内生菌亚群的侵染（Siciliano et al.,2001）.内生细菌对宿主的选择存在一定的专一性，因此，特定的宿主其内生细菌的群落结构具有相应的特异性.据不完全资料统计，已从近 30种植物分离到近 60个属的内生细菌（Kobayashi and Palumbo,2000），涉及的植物主要有小麦（王刚和李志强，2005）、水稻（沈德龙等，2000）、棉花（罗明等，2004）、花生（宋子红等，1999）、马铃薯（沈丽珍等，2008）、番茄（李艳琴等，2003）、黄瓜（王振跃等，2008）、辣椒（黎起秦等，2004）、甜瓜（周婧等，2008）、香蕉（付业勤等，2007）、烟草（彭细桥等，2007）等，研究的重点在于内生细菌作为生防因子的开发.水葫芦作为一种外来入侵物种，在不断适应外部环境的过程中，其内部微生态环境也形成了独特的结构，从而促进了水葫芦和生存环境的系统平衡，但到目前，水葫芦内生细菌的研究尚未见报道.

本研究引入脂肪酸生物标记分析方法，对水葫芦内生细菌进行研究.脂肪酸是生物体内不可缺少的能量和营养物质，是生物体的基本结构成分之一，作为细胞表面物质与细胞识别、种族特异性和细胞免疫等有密切关系.细菌的细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌的DNA具有高度的同源性，各种细菌均具有其特征性的细胞脂肪酸指纹图谱（Chen et al.,2008）.脂肪酸生物标记（PLFAs）能够灵敏地反应微生物群落产生的变化（刘波等，2009）.

为了利用微生物脂肪酸生物标记分析水葫芦内生细菌的种群组成，本研究从水葫芦植株中分离内生细菌，利用全自动微生物鉴定系统进行种类鉴定，分析研究内生细菌的脂肪酸生物标记的特性，为水葫芦内生细菌群落动态研究提供基础，从而为水葫芦的利用和防除提供新的思路.

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1 试验材料

菌株：从水葫芦植株分离纯化的内生细菌25株.气相色谱系统：美国Agilent 6890N型.包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器.分析软件：美国MIDI公司开发的基于微生物细胞脂肪酸成分鉴定的全自动微生物鉴定系统Sherlock MIS4.5（Microbial Identification System）和LGS4.5（Library Generation Software）.

2.2 试验方法

2.2.1 内生细菌的鉴定

a.脂肪酸的提取和气相色谱检测

脂肪酸的提取和气相色谱检测参考王秋红等（2007）.细菌培养采用TSBA培养基：30g胰蛋白胨大豆肉汤（TSB，购于Fisher公司）+15g琼脂+1L水.脂肪酸提取试剂：（1）皂化试剂：45g氢氧化钠+150mL甲醇+150mL水；（2） 甲基化试剂：325mL 6mol·L-1盐酸+275mL甲醇；（3）萃取试剂：200mL正已烷+200mL甲基叔丁基乙醚；（4）洗涤试剂：10.8g氢氧化钠+900mL水.配制方法由MIDI公司提供.

脂肪酸提取：（1）获菌：用接种环挑取3～5环（约40mg湿重）的菌落置入一个干净、干燥的有螺旋盖的试管中（最佳的获菌区域为第3区）；（2）皂化：加入（1.0±0.1）mL皂化试剂，拧紧盖子，振荡5～10s，放入95～100℃的沸水中5min，室温冷却，振荡5～10s，再水浴25min，室温冷却；（3）甲基化：开盖加入（2.0±0.1）mL甲基化试剂，拧紧盖子，振荡5～10s，（80±1）℃水浴10min，移开且快速用流动自来水冷却至室温；4）萃取：加入（1.25±0.1）mL的萃取试剂，拧紧盖子，温和混合旋转10min，打开管盖，利用干净的移液管取出每个样本的下层水相部份；（5）基本洗涤：加入（3.0±0.2）mL洗涤试剂，拧紧盖子，温和混合旋转5min，打开管盖，利用干净的移液管移出约2/3体积的上层有机相到干净的气相色谱检体小瓶，用于气相检测.

气相色谱检测：在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱温，170℃起始，5℃·min-1升至260℃，而后40℃·min-1升温至310℃，维持90s；汽化室温度250℃、检测器温度300℃；载气为氢气（2mL·min-1）、尾吹气为氮气（30mL·min-1）；柱前压10.00psi（1psi= 6.895kPa）；进样量1μL，进样分流比100：1.b.细菌种类鉴定（脂肪酸鉴定法）

系统根据各组分保留时间计算等链长（ECL）值确定目标组分的存在，采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，再将二者与系统谱库中的标准菌株数值匹配计算相似度（Similarity Index, SI），从而给出一种或几种可能的菌种鉴定结果.一般以最高SI的菌种名称作为鉴定结果，但当其报告的几个菌种的SI比较接近时，则根据色谱图特征及菌落生长特性进行综合判断.以脂肪酸混合标样校正保留时间（Moore-Kucera and Dick, 2007）.

2.2.2 水葫芦内生细菌脂肪酸生物标记特性分析

将鉴定出的内生细菌脂肪酸生物标记含量百分比列表分析，比较生物标记在各细菌中分布特性，包括高频次分布生物标记、中频次分布生物标记、低频次分布生物标记、微频次分布生物标记、特异性分布生物标记、无特异性生物标记的细菌等.以微杆菌为例，分析水葫芦内生细菌同属细菌脂肪酸生物标记的差异.以脂肪酸生物标记为指标，以菌种为样本，构建矩阵，将矩阵数据进行中心化处理，以欧氏距离为聚类尺度，用最小距离法对数据进行系统聚类分析（王秋红等，2007）.

3 结果与分析（Results and analysis）

3.1 水葫芦内生细菌的鉴定

水葫芦内生细菌的鉴定结果见表1，水葫芦主要内生细菌包括了14属的25种细菌，鉴定的相似性指数均大于0.5，为典型菌种.

表1 水葫芦内生细菌的鉴定Table 1 Identification of endophyte bacteria from Eichhornia crassipe（Mart.）Solms

3.2 水葫芦内生细菌脂肪酸生物标记的分布特性

水葫芦内生细菌脂肪酸生物标记的分布特性试验结果见表2.水葫芦内生细菌测定到27个有效脂肪酸生物标记，这些生物标记分为4种类型：

（1）高频次分布：脂肪酸生物标记在被测的25种细菌中出现概率很高，分布频次在 0.4815～0.8148之间，即在被测的25种细菌中，该类生物标记出现13～22次，属于这些生物标记的是16：0、15： 0 ANTEISO、15：0 ISO、17：0 ANTEISO、16：0 ISO，表明这些生物标记可以用于代表细菌总体类群.

（2）中频次分布：脂肪酸生物标记在被测的25细菌中出现概率中等，分布频次在0.1852～0.2593之间，即在被测的25种细菌中，该类生物标记出现5～7次，属于这些生物标记的是17：0 ISO、14：0 ISO、18：0、18：1 W7C、12：0、12：0 3OH、14：0，表明这些生物标记可以用于代表细菌属类群，如 12：0 3OH生物标记，指示着假单胞菌属.

表2 内生细菌磷脂脂肪酸生物标记反应值及各多样性指数Table 2 Distribution characteristics of PLFA biomarkers in endophyte bacteria from Eichhornia crassipe（Mart.）Solms

（3）低频次分布：脂肪酸生物标记在被测的25细菌种出现频次较低，分布概率在0.0741～0.1481之间，即在被测的25种细菌中，该类生物标记出现2～4次，属于这些生物标记的是12：0 2OH、10：0 3OH、18：1W9C、17：0CYCLO、TBSA10ME18：0、17：0、17：1 W8C、15：1 ANTEISO A、16：1 W11C，表明这些生物标记可以用于代表特定细菌种间差异，如15：1 ANTEISO A生物标记在Cellulomonas flavigena和Kocuria kristinae中有分布，其他种类没有分布.

（4）微频次分布：脂肪酸生物标记在被测的25种细菌中出现在一个细菌中，分布概率为0.0370，属于这些生物标记的是 ISO 17：1 W10C、13：0 ANTEISO、16：0 10 METHYL、16：0 3OH、16：1 W7C ALCOHOL、17：0 10 METHYL，表明可以用于代表细菌特征性生物标记.

第1～3类生物标记共21个，序号1～21，属于常规类型的生物标记，可用于微生物群落研究.第4类生物标记有6个，序号22～27，属于特殊类型的生物标记，指示着微生物种的特殊性，不用于微生物群落研究.

3.3 水葫芦内生细菌特征性脂肪酸生物标记

将微频次分布的6个生物标记作为水葫芦内生细菌特征性脂肪酸生物标记分析的数据，分析结果见表3.表中列出的6个特殊类型脂肪酸生物标记为6种细菌的特异性生物标记.Arthrobacter ureafaciens特异性生物标记为 13：0 ANTEISO（1.86%，脂肪酸生物标记含量，下同）；Bacillus pumilus的特异性生物标记为 ISO 17：1 W10C（4.49%）；Bacillus sphaericus的特异性生物标记为16：1 W7C ALCOHOL（11.61%）；Nocardia nova的特异性生物标记为 16：0 10 METHYL（0.66%）；Rhizobium rubi的特异性生物标记为 16：0 3OH（4.13%）；Rhodococcus rhodnii的特异性生物标记为17：0 10 METHYL（4.23%）.

表3 水葫芦细菌特征性脂肪酸生物标记Table 3 Special PLFA biomarkers for endophyte bacteria from Eichhornia crassipe（Mart.）Solms

3.4 无特异性脂肪酸生物标记的水葫芦内生细菌

将微频次分布的6个脂肪酸生物标记作为分析无特异性脂肪酸生物标记的水葫芦内生细菌的数据，分析结果列表4.1Acinetobacter calcoaceticus、2Arthrobacter globiformis、 4Bacillus megaterium、7Cellulomonas flavigena、8Kocuria kristinae、9Microbacterium barkeri、10Microbacterium esteraromaticum、11Microbacterium imperiale、12Microbacterium lacticum、13Microbacterium liquefaciens、14Micrococcus luteus、15Nesterenkonia halobia、17Paenibacillus macerans、18Paucimonas lemoignei、19Pseudomonas fluorescens、20Pseudomonas putida、21Pseudomonas vancouverensis、23Rhodococcuserythropolis、25Xanthobacter flavus，这19个菌株均不含有特异性脂肪酸生物标记.

表4 无特异性脂肪酸生物标记的水葫芦内生细菌Table 4 Endophyte bacteria without special PLFA biomarkers

3.5 水葫芦内生细菌同属细菌脂肪酸生物标记的差异

3.5.1 脂肪酸生物标记的差异分析

选择5株微杆菌属细菌，脂肪酸生物标记列于表5.以菌种为指标，以脂肪酸生物标记为样本，构建矩阵，以欧氏距离为聚类尺度，用最短距离法对数据进行系统聚类分析，分析结果见图1.当λ= 24.86时，可将微杆菌属的脂肪酸生物标记分为3类，第1类包括了4个脂肪酸生物标记，即16：0、15：0 ISO、17：0 ISO和14：0 ISO，其特点为这些生物标记在微杆菌属不同种细菌中含量极低或为零.第2类包括了 2个脂肪酸生物标记，即 17：0 ANTEISO和16：0 ISO，其特点为这些生物标记在微杆菌属不同种细菌中含量较高，分布比例较均衡.第3类包括 1个脂肪酸生物标记，即 15：0 ANTEISO，其特点为这些生物标记在微杆菌属不同种的细菌中较高且分布均衡.

表5 微杆菌属不同种的脂肪酸生物标记的差异Table 5 Variation of PLFA biomarkers in the species of Microbacterium genus

图1 微杆菌属不同种的脂肪酸生物标记聚类分析Fig.1 Cluster analysis of PLFA biomarkers in the species of Microbacterium genus

3.5.2 微杆菌属细菌种的差异分析

图2 微杆菌属不同种的聚类分析Fig.2 Cluster analysis for Microbacterium genus tested

以脂肪酸生物标记为指标，以菌株为样本，构建矩阵，以欧氏距离为聚类尺度，用最短距离法对数据进行系统聚类分析，分析结果见图2.当λ= 11.24时，可将菌株分为2类.第一类包括菌株9Microbacterium barkeri和11Microbacterium imperiale，这两个菌株17：0 ISO和14：0 ISO的脂肪酸生物标记含量均为 0.第二类包括 10Microbacterium esteraromaticum、12Microbacterium lacticum和13Microbacterium liquefaciens，这 3个菌株均含有17：0 ISO脂肪酸生物标记而区别于第一类菌株.

3.6 基于脂肪酸生物标记的水葫芦内生细菌聚类分析

将高频次、中频次、低频次分布的25个细菌脂肪酸生物标记列表6.以脂肪酸生物标记为指标，以菌种为样本，构建矩阵，以欧氏距离为聚类尺度，用最短距离法对数据进行系统聚类分析，分析结果见图3.当λ=31.99时，可将25株水葫芦内生细菌分为4类：

第一类包括4个菌株，1Acinetobacter calcoaceticus（不动杆菌属醋酸钙种）、16Nocardia nova、23Rhodococcus erythropolis（红串红球菌）和24Rhodococcus rhodnii.这类细菌均含有特征脂肪酸生物标记18：1 W9C.

第二类包括 4个菌株分别是 18Paucimonas lemoignei、19Pseudomonas fluorescens（荧光假单胞菌）、20Pseudomonas putida（恋臭假单胞菌）、21Pseudomonas vancouverensis.菌株主要脂肪酸生物标记为16：0、18：1 W7C、12：0、12：0 3OH和17：0 CYCLO.

第三类包括 2个菌株，22Rhizobium rubi和25Xanthobacter flavus（黄黄色杆菌），菌株特征脂肪酸生物标记为18：1 W7C.

第四类包括15个菌株，分别是2Arthrobacter globiformis（球状节杆菌）、3Arthrobacter ureafacien（烟草节杆菌）、4Bacillus megaterium（巨大芽孢杆菌）、5Bacillus pumilus（短小芽孢杆菌）、6Bacillus sphaericus（球形芽孢杆菌）、7Cellulomonas flavigena（产黄纤维单胞菌）、8Kocuria kristinae（克氏库克菌（克氏微球菌）、9Microbacterium barkeri、10Microbacterium esteraromaticum、11Microbacterium imperiale（微小杆菌）、12Microbacterium lacticum、13Microbacterium liquefaciens、14Micrococcusluteus（藤黄微球菌）、15Nesterenkonia halobia（盐生内斯特兰克菌）、17Paenibacillus macerans（浸麻芽孢杆菌）.这类菌株主要的脂肪酸生物标记为16：0、15：0 ANTEISO、15：0 ISO、17：0 ANTEISO和16：0 ISO.

图3 菌株系统聚类图Fig.3 Cluster analysis for endophyte bacteria system

表6 细菌主要脂肪酸生物标记Table6Themainbacterium PLFA biomarkers

4 讨论（Discussion）

有关植物内生细菌的研究，已经逐渐成为一个热点，研究包括内生细菌的分离、鉴定（Steenhoudt and Vanderleyden,2000;Sturz et al.,1997;Dong et al.,1994）；作为植物病害生物防治因子的开发，如假单胞菌属（Pseudomonas）（Ravel et al.,1997;刘国奇和蒋如璋，1999;黎起秦等，2004），芽孢杆菌属（Bacillus）（Ravel et al.,1997;马艳等，2006;黎起秦等，2006;何红等，2004）；作为人类疾病或保健药品的新的来源等等（Castillo et al.,2002）.植物内生细菌作为植物微生态系统中天然组成成分，它们可能促进了寄主植物对环境的适应，加强了系统的生态平衡（王万能等，2005）.Lacava1等（2004）研究表明，在成熟的柑橘植株体内，内生菌代表的小生境变得更加稳定和均衡，从而导致一种选择压力，这种选择压力更加适合刺激每个定殖微生物种群的基因型.因此，内生细菌可能表现出一种调节自身到更稳定环境的趋势，结果导致彼此间更紧密的相互作用.本研究利用脂肪酸鉴定技术对水葫芦25株内生细菌进行鉴定，共有14个属，分别是不动杆菌属（Acinetobacter）、节杆菌属（Arthrobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）、库克菌属（Kocuria）、微杆菌属（Microbacterium）、微球菌属（Micrococcus）、涅斯捷连科氏菌属（Nesterenkonia）、奴卡菌属（Nocardia）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、Paucimonas、假单胞菌属（Pseudomonas）、根瘤菌属（Rhizobium）、红球菌属（Rhodococcus）、黄色杆菌属（Xanthobacter）.其中微杆菌属（Microbacterium）种类最多，有5个种；芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）均有3个种.

分离鉴定的结果表明水葫芦有比较丰富的内生细菌.一部分内生菌在其他植物已有研究报道，如芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）为最常见属（邹文欣等谭仁祥，2001），含有许多作为生防因子开发的菌株（罗明等，2004;姚丽瑾等，2008;殷晓敏等，2008;石晶盈等，2007）；微杆菌（Microbacterium）（黎起秦等，2006）、不动杆菌（Acinetobacter）（付业勤等，2007;陈欣等，2006）、节杆菌（Arthrobacter）和黄色杆菌（Xanthobacter）（祝明亮等，2004）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）（饶小莉 等 ，2007）、根瘤菌属（Rhizobium）（欧江，2007;曹月青和殷幼平，2001）等，也广泛地分布在不同的植物内，并有不少关于它们的生物学特性和功能研究的报道.另一部分内生细菌，如纤维单胞菌属（Cellulomonas）（Elberson et al.,2000;欧江，2007;曹月青和殷幼平，2001）、库克菌属（Kocuria）（Kim et al.,2004;陈华红等，2004a）、微球菌属（Micrococcus）（Reddy et al.,2000;潘利华等，2003）、涅斯捷连科氏菌属（Nesterenkonia）（Li et al.,2008;陈华红等，2004b）、奴卡菌属（Nocardia）（Kageyama et al.,2004;刘月廉等，2006）、Paucimonas（Kämpfer et al.,2007）、红球菌属（Rhodococcus）（Matsuyama et al.,2003），从水葫芦植株分离出来，未见从其它植物体内分离的报道.

利用脂肪酸分析细菌属、种及亚种的差异.脂肪酸是生物体内不可缺少的能量和营养物质，是生物体的基本结构成分之一，已被成功的用于细菌属、种和亚种的鉴定（Abel et al.,1963;Athalye et al.,1985;Bernard et al.,1991;张国赏等，2000;刘志辉等，2005）.如葡萄球菌属（Staphylococcus）含有19：0ISO、19：0ANTEISO和C20：0而区别于微球菌属（Micrococcus）（Coloe et al.,1986）.本研究利用脂肪酸生物标记分析技术，分析水葫芦内生细菌的特殊类型脂肪酸，共有6个特殊类型脂肪酸生物标记为6种内生细菌的特异性生物标记，如Arthrobacter ureafaciens特异性生物标记为13：0 ANTEISO（1.86%），Bacillus pumilus特异性生物标记为 ISO 17：1 W10C（4.49%），Bacillus sphaericus特异性生物标记为16：1W7C ALCOHOL（11.61%），Nocardia nova特异性生物标记为16：0 10 METHYL（0.66%），Rhizobium rubi特异性生物标记为16：0 3OH（4.13%），Rhodococcus rhodnii特异性生物标记为17：0 10 METHYL（4.23%）.

Coloe等（1986）成功利用细胞脂肪酸技术分析多株来源于人类和动物体分离的空肠弯杆菌（Campylobacter jejuni）.C18：1到 C19：0cys的比率用于代表分离的3个类群，结果，来源于人类的85%菌株和源自动物的56%菌株可分别代表各自的群体.如，来源于人类的菌株中，分属于类群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的菌株C18：1的含量分别为14、21和37%，而C19：0cys的含量分别为41%、43%和48%（Coloe et al.,1986）.本研究选择5株微杆菌属细菌，以菌种为指标，以脂肪酸生物标记为样本，构建矩阵，以欧氏距离为聚类尺度，用最短距离法对数据进行系统聚类分析.可将微杆菌属的脂肪酸生物标记分为3类，第1类包括了4个脂肪酸生物标记，即16：0、15：0 ISO、17：0 ISO和14：0 ISO，其特点为这些生物标记在微杆菌属不同种细菌中含量极低或为零.第2类包括了2个脂肪酸生物标记，即17：0 ANTEISO和16：0 ISO，其特点为这些生物标记在微杆菌属不同种细菌中含量较高，分布比例较均衡.第3类包括1个脂肪酸生物标记，即15：0 ANTEISO，其特点为这些生物标记在微杆菌属不同种的细菌中较高且分布均衡.

利用脂肪酸生物标记技术，检测到水葫芦内生细菌27个有效脂肪酸生物标记，这些生物标记分为4种类型：（1）高频次分布：在被测的25种细菌中，该类生物标记出现13～22次，属于这些生物标记 的 是 16：0、15：0 ANTEISO、15：0 ISO、17：0 ANTEISO、16：0 ISO，表明这些生物标记可以用于代表细菌总体类群.（2）中频次分布：在被测的25种细菌中，该类生物标记出现5～7次，属于这些生物标记的是17：0 ISO、14：0 ISO、18：0、18：1 W7C、12：0、12：0 3OH、14：0，表明这些生物标记可以用于代表细菌属类群，如12：0 3OH生物标记，指示着假单胞菌属.（3）低频次分布：在被测的25种细菌中，该类生物标记出现2～4次，属于这些生物标记的 是 12：0 2OH、10：0 3OH、18：1 W9C、17：0 CYCLO、TBSA 10ME18：0、17：0、17：1 W8C、15：1 ANTEISO A、16：1 W11C，表明这些生物标记可以用于代表特定细菌种间差异，如15：1 ANTEISO A生 物 标 记 在 Cellulomonasflavigena和 Kocuria kristinae中有分布，其他种类没有分布.（4）微频次分布：脂肪酸生物标记在被测的25细菌中出现在一个细菌中，属于这些生物标记的是 ISO 17：1 W10C、13：0 ANTEISO、16：0 10 METHYL、16：0 3OH、16：1 W7C ALCOHOL、17：0 10 METHYL，表明可以用于代表细菌特征性生物标记.

利用脂肪酸生物标记技术，可将分离鉴定的水葫芦内生细菌分为3类，第一类包括4个菌株，这类细菌均含有特征脂肪酸生物标记18：1 W9C.第二类包括4个菌株，菌株主要脂肪酸生物标记为16：0、18：1 W7C、12：0、12：0 3OH和17：0 CYCLO.第三类包括2个菌株，菌株特征脂肪酸生物标记为18：1 W7C.第四类包括15个菌株，这类菌株主要的脂肪酸生物标记为 16：0、15：0 ANTEISO、15：0 ISO、17：0 ANTEISO和16：0 ISO.

Abel K,deSchmertzing H,Peterson J L.1963.Classification of microorganisms by analysis of chemical composition.I.Feasibility of utilizing gas chromatography［J］.Journal of Bacteriology,85：1039-1044

AthalyeM,NobleW C,MinnikinD E.1985.Analysisof cellularfatty acidsby gaschromatography asatoolin the identification ofmedically importantcoryneform bacteria［J］.Journal of Applied Bacteriology,58（5）：507-512

Bernard K A,Bellefeuille M,Ewan E P.1991.Cellular fatty acid composition as an adjunct to the identification of asporogenous,aerobic gram positive rods［J］.Journal of Clinical Microbiology,29（1）：83-89

Cao Y Q,Yin Y P,Dong Y M,He Z B.2001.Isolation and identification of the cellulose-utilizing bacteria from the gut of apriona germati（Hope）［J］.Microbiology,28（1）：9-11（in Chinese）

Castillo U F,Strobel G A,Ford E J,Hess W M,Porter H, Jensen J B,Albert H,Robison R,Condron M A M,Teplow D B,StevensD,YaverD.2002.Munumbicins,widespectrum antibiotics produced by Streptomyces（NRRL30562）endophytic on Kennedia nigriscans［J］.Microbiology,148（9）：2675-2685

Chen H H,Li W J,XU L H,Jiang C L.2004.Isolation and phylogenetic analysis of an alkaliphilic strain of the genus Kocuria［J］.Journal of Yunnan University（Natural Sciences）,26（B07）：208-211（in Chinese）

Chen H H,Li W J,Zhang Y Q,Wang D,Tang S K.2004.Study on isolation and systematic taxonomy of strains of genus Nesterenkonia［J］.Acta Microbiologica Sinica,44（6）：811-815（in Chinese）

Chen X,Liu C H,Wang Y Y,Gu Y C,Xing Y,Tang C. 2006.Research on the Isolation and the Antifungal Mechanism of Endophytic Bacterium—ZJ1105［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences,34（24）：6535-6536（in Chinese）

Chen Y,Dumont M G,McNamara N P,Chamberlain P M, Bodrossy L,Stralis-Pavese N,Murrell J C.2008.Diversity of the active methanotrophic community in acidic peatlands as assessed by mRNA and SIP PLFA analyses［J］.Environmental Microbiology,10（2）：446-459

Coloe P J,Slattery J F,Cavanaugh P,Vanghan J.1986.The cellular fatty acid composition of Canpylobacter species isolated from cases of enteritis in man and animails［J］.Journal of Hygiene,96（2）：225-229

DiFioreS,DelGallo M.1995.Endophyticbacteria:their possible role in the host plants［A］.//Fendrik I,Del Gallo M, Vanderleyden J,De Zamaroczy M.Azospirilum VI and Related Microrganisms［C］.Berlin:Springer-Verlag,169-187

Dong Z,Canny M J,McCully M E,Roboredo M R,Cabadilla C F,Ortega E,Rodes R.1994.A nitrogenfixingendophyte of sugarcane stems［J］.Plant Physiology,105（4）：1139-1147

Elberson M A,Malekzadeh F,Yazdi M T,KameranpourN, Noori-Daloii M R,Matte M H,Shahamat M,Colwell R R, Sowers K R.2000.Cellulomonas persica sp.nov.and Cellulomonas iranensis sp.nov.,mesophilic cellulose-degrading bacteria isolated from forestsoils［J］.InternationalJournalofSystematic and Evolutionary Microbiology,50：993-996

Fu Y Q,Cai J M,Liu X B,Huang G X.2007.Isolation, bioactivity evaluation and quantity distribution of endophytic bacteria in banana［J］.Chinese Journal of Tropical Crops,28（4）：78-83（in Chinese）

He H,Cai X Q,Lan C Z,Guan X,Hu F P.2004.Colonization, promotion growth and biocontrol for anthracnose of endophytic bacterium BS-2 from Capsicum annuum in cabbage［J］.Acta Phytophylacica Sinica,31（4）：347-352（in Chinese）

KageyamaA,YazawaK,NishimuraK,MikamiY.2004.Nocardia inohanensis sp.nov.,Nocardia yamanashiensis sp.nov. and Nocardia niigatensis sp. nov., isolated from clinical specimens［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,54：563-569

Kämpfer P,Rosselló-Mora R,Hermansson M,Persson F,Huber B,Falsen E,Busse H J.2007.Undibacterium pigrum gen.nov., sp.nov.,isolated from drinking water［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,57：1510-1515

Kim S B,Nedashkovskaya O I,Mikhailov V V,Han S K,Kim K O,Rhee M S,Bae K S.2004.Kocuria marina sp.nov.,a novel actinobacterium isolated from marine sediment［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54（Pt 5）:1617-1620

Kobayashi D Y,Palumbo J D.2000.Bacterial endophytes and their effects on plants and uses in agriculture［A］.//Bacon C W,White J F.Microbial Endophytes［C］.New York:Marcel Dekker,Inc.

Lacava P T,Araújo W L,Marcon J,Maccheroni W Jr,Azevedo J L.2004.Interaction between endophytic bacteria from citrus plants and the phytopathogenic bacteria Xylella fastidiosa,causal agentofcitrus variegated chlorosis［J］.Letters in Applied Microbiology,39（1）：55-59

Li Q Q,Lu J Y,Lin W,Chen Y N,Lu T J,Xie Y L,Wei W L.2004.Isolation of pepper endophyte antagonists against Ralstonia solanacearum［J］.Journal of Guangxi Agricultural and Biological Science,23（4）：304-306（in Chinese）

Li Q Q,Xie Y L,Lin W,Wei J G,Luo K.2006.Distribution and diversity of endophytic bacteria in tomato plants from Guangxi［J］.Biodiversity Science,14（6）：534-540（in Chinese）

Li W J,Zhang Y Q,Schumann P,Liu H Y,Yu L Y,Zhang Y Q,Stackebrandt E,Xu L H,Jiang C L.2008.Nesterenkonia halophila sp. nov., a moderately halophilic, alkalitolerant actinobacterium isolated from a saline soil［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,58：1359-1363

LiY Q,ShenQ,LiuB B,ZhangH,ZhaoL P.2003. Identification of endophytes from tomato seedlings and analysis of DNA fingerprints using ERIC-PCR［J］.Microbiology,30（5）：89-92（in Chinese）

Liu B,Lan J L,Lin Y Z,Guan X F,Zhu C X.2009.Characteristics of PLFA biomarkers for acephatemet resistant bacteria isolated from the soils［J］.Asian Journal of Ecotoxicology,4（5）：734-744（in Chinese）

Liu G Q,Jiang R Z.1999.Isolation and preliminary study on pseudomonas fluorescent rhizobacterial strain from Chinese chives［J］.Microbiology,26（3）：189-192（in Chinese）

Liu Y L,Lv Q F,Pan S M,Yuan H X.2006.Microorganism isolated from litters of the stands of eucalyptus［J］.Journal of Nanjing Forestry University（Natural Sciences）,30（1）：75-78（in Chinese）

Liu Z H,Cai X S,Zhu P B,Guan P,Xu W H,Wu L Z. 2005.Study on speciesidentification ofmysobacteria by gas chromatography analysis of whole-cell fatty acid［J］.28（6）：403-406（in Chinese）

Luo M,LuY,Zhang X L.2004.Isolation ofendophytic bacteria from cotton and screening of antagonistic bacteria［J］. Xinjiang Agricultural Sciences,41（5）：277-282（in Chinese）

Ma Y,Zhao J T,Chang Z Z,Huang H Y,Ye X M,Zhang J Y.2006.Antagonistic activity of an endophytic strain BS211 of bacillius subtilis and its biocontrol efficacy against fusarium wilt of watermelon［J］.Jiangsu Journal of Agricultural Sciences,22（4）：388-393（in Chinese）

Matsuyama H,Yumoto I,Kudo T,Shida O.2003.Rhodococcus tukisamuensis sp.nov.,isolated from soil［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,53：1333-1337

Moore-Kucera J,Dick R P.2008.PLFA profiling of microbial community structure and seasonal shifts in soils of a Douglas-fir chronosequence［J］.Microbial Ecology,55（3）：500-511

Pan L H,Jiang S T,Liu P D,Li H X.2003.Screening and characterization of a phenol-degrading bacterium［J］.Microbiology, 30（5）：78-81（in Chinese）

Peng X Q,Zhou G S,Deng Z P,Kuang C F,Luo K,Liu H Y.2007.Screening,identification and control efficacy of tobacco antagonistic endophytic bacteria againstRalstonia solanacearum［J］.Acta Phytopathologica Sinica,37（6）：670-674（in Chinese）

Rao X L,Shen D L,Li J,Jiang X,Li L,Zhang M,Feng R H.2007.Isolation of endophytic bacteria from glycyrrhiza and identifying of antagonistic bacteria［J］.Microbiology,34（4）：700-704（in Chinese）

RavelC,Courty,CoudretA,CharmetG.1997.Beneficial effects of Neotyphodium lolii on the growth and the water status in perennialryegrass cultivated undernitrogen deficiency or drought stress［J］.Agronomie,17：173-181

Reddy G S,Aggarwal R K,Matsumoto G I,Shivaji S.2000.Arthrobacter flavus sp.nov.,a psychrophilic bacterium isolated from a pond in McMurdo Dry Valley,Antarctica［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,50：1553-1561

Shi J Y,Liu A Y,Feng S J,Li X P,Chen W X.2007.Identification and biocontrol effect of endophytic bacterial strain MG-Y2 isolated from papaya［J］.Journal of Fruit Science,24（6）：810-814（in Chinese）

Siciliano S D,Fortin N,Mihoc A,Wisse G,Labelle S, Beaumier D,Ouellette D,Roy R,Whyte L G,Banks M K, SchwabP,LeeK,GreerC W.2001.Selection ofspecific endophytic bacterialgenotypesby plantsin response to soil contamination［J］.Applied Environmental Microbiology,67（6）：2469-2475

Song Z H,Ding L X,Ma B J,Li WZ,Mei R H.1999. Studies on the population and dynamic analysis of peanut endophytes［J］.Acta Phytophylacica Sinica,26（4）：309-314（in Chinese）

Steenhoudt O,Vanderleyden J.2000.Azospirillum,a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses:genetic, biochemicaland ecologicalaspects［J］.Fems Microbiology Revies,24：487-506

Sturz A V,Christie B R,Matheson B G,Nowak J.1997. Biodiversity ofendophytic bacteria which colonize red clover nodules,roots,stems and foliage and their influence on host growth［J］.Biology and Fertility of Soils,25（1）：13-19

Wang G,LiZ Q.2005.Isolation ofendophyticcolonizing bacteria from wheat and its antagonism on the wheat pathogenic fungi of Rhizoctonia cerealis［J］.Microbiology,32（2）：20-24（in Chinese）

Wang Q H,Chen L,Lin Y Z,Zhu Y J,Lan J L,Yang S J, Liu B. 2007. Polymorphism of fatty acid of Ralstonia solanacearum in Fujian Province［J］.Scientia Agricultrua Sinica, 39（8）：1675-1687（in Chinese）

Wang W N,Quan X J,Xie Y Y.2005.Biological control of plant diseases and micro-ecology［J］.China Plant Protection,25（3）：7-9（in Chinese）

Wang Z Y,Wang M,Gao S F,Zhang M,Yuan H X,Li H L. 2008.Phyllosphere and endophytic microflora in greenhouse cucumber leaves［J］.Chinese Journal of Ecology,27（3）：425-428（in Chinese）

Yao L J,Wang Q,Fu X C,Mei R H.2008.Isolation and identification of endophytic bacteria antagonistic to wheat sharp eyespot disease［J］.Chinese Journal of Biological Control,24（1）：53-57（in Chinese）

Yin X M,Chen D,Zheng F C.2008.Study on antagonistic action of endophytic strain Bacillus subtilis against Curvularia leaf spot［J］.Guangdong Agricultural Sciences,（2）：61-63（in Chinese）Zhang G S,Wu W J,Pan R R.2000.Determination of fatty acidsin cells by GC-MS and its application in bacterium identification［J］.Journal of Hefei Union University,10（4）：92-96（in Chinese）

Zhou Q,Gao Z G,He X L,Zhuang J H,Zhang X F,Wu H Y.2008.Selection ofendophytic bacteria forsuppression of melon wilt caused by Fusarium oxysporum ［J］.Northern Horticulture,（2）：225-227（in Chinese）

Zhu M L,Li T F,Wang A Y.2004.Isolation and identifation of endophytic bacteria in burley tobacco and reducton to TSNA contents of burley tobacco［J］.Acta Microbiologica Sinica,44（4）：422-426（in Chinese）

ZouW X,TanR X.2001.Recentadvancesonendophyte research,Acta Botanica Sinica,43（9）：881-892（in Chinese）

中文参考文献

曹月青,殷幼平,董亚敏,何正波.2001.桑粒肩天牛肠道纤维素分解细菌的分离和鉴定［J］.微生物通报,28（1）：9-11

陈华红,李文均,徐丽华,姜成林.2004.1株嗜碱克氏菌属菌株的分离及系统发育分析［J］.云南大学学报（自然科学版）, 26（B07）：208-211

陈华红,李文均,张玉琴,王栋,唐蜀昆.2004.涅斯捷连科氏菌属菌株的分离及系统学研究［J］.微生物学报,44（6）：811-815

陈欣,刘常宏,王艳艳,顾玉诚,幸颖,汤城.2006.内生细菌ZJ1105的分离及其抗真菌机制的研究［J］.安徽农业科学,34（24）：6535-6536

段惠,强胜,吴海荣,林金诚.2003.水葫芦（Eichhomia crassipes（Mart.）Solms.）［J］.杂草科学,（2）：39-40

付业勤,蔡吉苗,刘先宝,黄贵修.2007.香蕉内生细菌分离、活性评价及数量分布［J］.热带作物学报,28（4）：78-83

何红,蔡学清,兰成忠,关雄,胡方平.2004.辣椒内生菌BS-2在白菜体内定殖、促生和防炭疽病的作用［J］.植物保护学报, 31（4）：347-352

黎起秦,卢继英,林纬,陈永宁,卢亭君,谢义灵,韦文亮.2004.辣椒内生菌拮抗细菌的筛选［J］.广西农业生物科学, 23（4）：304-306

黎起秦,谢义灵,林纬,韦继光,罗宽.2006.广西番茄内生细菌的多样性和数量动态［J］.生物多样性,14（6）：534-540

李艳琴,申泉,刘彬彬,张华,赵立平.2003.番茄内生菌分离及其ERIC-PCR指纹图谱分析［J］.微生物通报,30（5）：89-92

刘波,蓝江林,林营志,官雪芳,朱昌雄.2009.土壤甲胺磷抗性细菌种群特征脂肪酸生物标记的分析［J］.生态毒理学报,4（5）：734-744

刘国奇,蒋如璋.1999.韭菜根际荧光假单胞菌株的分离和初步研究［J］.微生物学通报,26（3）：189-192

刘月廉,吕庆芳,潘颂民,袁红旭.2006.桉树林分枯落物分解微生物的种类和数量［J］.南京林业大学学报（自然科学版）, 30（1）：75-78

刘志辉,蔡杏珊,竺澎波,关平,许婉华,吴龙章.2005.应用气相色谱技术分析全细胞脂肪酸快速鉴定分枝杆菌［J］.中华结核和呼吸杂志,28（6）：403-406

罗明,芦云,张祥林.2004.棉花内生细菌的分离及生防益菌的筛选［J］.新疆农业科学,41（5）：277-282

马艳,赵江涛,常志州,黄红英,叶小梅,张建英.2006.西瓜内生枯草芽孢杆菌BS211的拮抗活性及盆栽防效［J］.江苏农业学报,22（4）：388-393

欧江.2007.高活性纤维降解菌的分离鉴定［J］.四川食品与发酵,43（4）：57-59

潘利华,姜绍通,刘鹏达,李慧星.2003.苯酚降解菌的筛选及其降解特性的初步研究［J］.微生物学通报,30（5）：78-81

彭细桥,周国生,邓正平,匡传富,罗宽,刘红艳.2007.烟草青枯病内生拮抗菌的筛选、鉴定及其防效测定［J］.植物病理学报,37（6）：670-674

饶小莉,沈德龙,李俊,姜昕,李力,张敏,冯瑞华.2007.甘草内生细菌的分离及拮抗菌株鉴定［J］.微生物学通报,34（4）：700-704

沈德龙,宋未,东秀珠,蔡妙英.2000.水稻内生优势菌——成团肠杆菌的鉴定及其系统发育学分析［J］.自然科学进展,10（10）：949-952

沈丽珍,梁峰,王忠,王全逸,陈敏,杨桂娟,杨清.马铃薯内生细菌 StC01的鉴定与促生作用［J］.江苏农业科学,（1）：143-146

石晶盈,刘爱媛,冯淑杰,李雪萍,陈维信.2007.番木瓜内生细菌MG-Y2的鉴定及其生防作用［J］.果树学报,24（6）：810-814

宋子红,丁立孝,马伯军,李文泽,梅汝鸿.1999.花生内生菌的种群及动态分析［J］.植物保护学报,26（4）：309-314

王刚,李志强.2005.小麦内生细菌的分离及其对小麦纹枯病的拮抗作用［J］.微生物通报,32（2）：20-24

王秋红,陈亮,林营志,朱育菁,蓝江林,杨淑佳,刘波.2007.福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究［J］.中国农业科学, 39（8）：1675-1687

王万能,全学军,谢应宇.2005.植物病害生物防治与微生态学［J］.中国植保导刊,25（3）：7-9

王振跃,汪敏,高书锋,张猛,袁虹霞,李洪连.2008.温室黄瓜叶部微生物区系［J］.生态学杂志,27（3）：425-428

姚丽瑾,王琦,付学池,梅汝鸿.2008.小麦纹枯病生防芽孢杆菌的筛选及鉴定［J］.中国生物防治,24（1）：53-57

殷晓敏,陈弟,郑服丛.2008.内生枯草芽孢杆菌B215对香蕉弯孢霉叶斑病抑制作用初探［J］.广东农业科学,（2）：61-63

张国赏,吴文娟,潘仁瑞.2000.气相色谱-质谱法检测细胞脂肪酸及其在细菌鉴定上的应用［J］.合肥联合大学学报,10（4）：92-96

周婧,高增贵,何秀玲,庄敬华,张小飞,吴海云.2008.甜瓜枯萎病拮抗内生细菌筛选研究［J］.北方园艺,（2）：225-227

祝明亮,李天飞,汪安云.2004.白肋烟内生细菌的分离鉴定及降低N-亚硝铵含量研究［J］.微生物学报,44（4）：422-426

邹文欣,谭仁祥.2001.植物内生菌研究新进展［J］.植物学报,43（9）：881-892

CharacteristicsofPLFA BiomarkersfortheEndophyteBacteria inside Eichhornia crassipe（Mart.）Solms

LAN Jiang-lin，LIU Bo*，ZHU Yu-jing，LIN Ying-zhi，GE Ci-bin，LIU Yun
Agricultural Bioresource Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003

1673-5897（2010）2-242-13

X522

A

刘波，博士，研究员，主要从事微生物生物技术和微生物农药研究.

2009-05-23 录用日期：2009-07-15

福建省发改委项目（闽发高技［2005］1061号）；省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金（No.STIF Y03）

蓝江林（1972─），副研究员，E-mail:lanfz2008@163.com；*通讯作者（Corresponding author），E-mail:fzliubo@163. com