超高效液相色谱-串联质谱法测定苹果中的赤霉素、脱落酸、甲萘威、多效唑和烯效唑残的残留量

张 慧，吴 颖，路 勇，张卫民，姜 洁，冯 楠，谢文东

（1.北京市产品质量监督检验所，北京100026；2.北京市食品安全监控中心，北京100041）

超高效液相色谱-串联质谱法测定苹果中的赤霉素、脱落酸、甲萘威、多效唑和烯效唑残的残留量

张 慧1，吴 颖1，路 勇2，张卫民2，姜 洁2，冯 楠2，谢文东2

（1.北京市产品质量监督检验所，北京100026；2.北京市食品安全监控中心，北京100041）

建立用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定苹果中赤霉素、脱落酸、甲萘威、多效唑和烯效唑残留量的方法。用甲醇-水溶液提取样品中的植物生长调节剂，经固相萃取柱净化，用UPLC-MS/MS分析，采用多反应监测模式，外标法定量。采用BEH Shield RP18色谱柱，以乙酸铵和乙腈为流动相，进行梯度洗脱。结论：操作简单快捷，方法准确度和稳定性好。

超高效液相色谱-串联质谱法，苹果，赤霉素，脱落酸，甲萘威，多效唑，烯效唑，检测

Abstract：A method for the determination of gibberellin，carbaryl，abscisic acid，paclobutrazol and uniconazole in apples was established by HPLC/MS.The sample was extracted with methanol-water as extraction solvents，then cleaned up with solid-phase extraction.The analyte was determined by multi-reaction monitoring（MRM）mode was employed for the quantitative determination，and quantified by the external standard curve.The separation was performed on a UPLC BEH Shield RP18column by gradient elution with a system of wate（rcontaining 5mmol/L ammonium acetate buffer）-acetonitrile as mobile phase.Conclusion：The method is simple，accurate and suitable for the identification and quantification.

Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；apple；gibberellin；abscisic acid；carbaryl；paclobutrazol；uniconazole；determination

生长调节剂可分为两大类：植物生长调节剂和昆虫生长调节剂。目前主要使用的生长调节剂主要包括：赤霉素、多效唑、烯效唑等几类物质。近年来，生长调节剂应用日益广泛，我国是世界上应用生长调节剂最广泛的国家，主要用作调节农作物的生长发育、提高产量和改良品质。然而，生长调节剂与其他农药一样，也有一定的毒性。特别是近年来，由于生长调节剂的滥用及使用不当导致的食品安全问题逐渐增多，引起了人们的关注，但对多种组分的检测方法研究还很少，有的还缺乏相关检测标准。目前

报道的关于赤霉素和（或）脱落酸的检测方法有气相色谱法［1］、高效液相色谱法［2-3］、液质联用法［4］、薄层层析法［5］，多效唑、烯效唑和甲萘威的检测方法有气相色谱法［6］、液相色谱法［7-9］，但各类方法最多只能检测其中的两种物质，不能同时将这五种物质检出，并且存在样品前处理过程复杂、溶剂消耗多、分析时间长等问题。本文建立了同时检测苹果中赤霉素、甲萘威、脱落酸、多效唑、烯效唑的超高效液相色谱及串联质谱方法。超高效液相色谱及串联质谱具有超高分离度、超高速度、超高灵敏度等特点，用于生长调节剂检测研究较少，此方法的开发，可大大减少样品分析时间。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

赤霉素、甲萘威、脱落酸、多效唑和烯效唑标准品 购于Dr.Ehrenstorfer公司；100!g/mL标准品储备液 由甲醇溶解，并置于4℃冰箱中密封保存；色谱纯甲醇、乙腈、乙酸铵 购于Dikma公司；实验用水 为超纯水；混标溶液 准确吸取100!L的甲萘威、多效唑、烯效唑和1mL的赤霉素、脱落酸，用甲醇定容至10mL的容量瓶中，配制成混标，含甲萘威、多效唑、烯效唑1!g/mL，赤霉素、脱落酸10!g/mL。

Waters ACQULITY UPLC超高效液相色谱仪，Waters ACQULITY TQD 质谱仪 Waters，USA；高速冷冻离心机 SIGMA，德国；均质机，氮吹仪，色谱柱（ACQULITY UPLC BEH Shield RP18 2.1×50mm，1.7!m）。

1.2 色谱分析条件

1.2.1 液相色谱操作条件 流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样体积：10!L；流动相：A为5mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈；梯度洗脱条件如表1。

表1 液相梯度条件

1.2.2 质谱检测条件 ESI-（0～2.2min），ESI+（2.2～6min），毛细管电压2.8kV，离子桥电压0.5V，离子源温度100℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂气500L/h，锥孔气100L/h；质谱分析条件见表2。

表2 质谱分析参数

1.3 样品前处理

称取样品10g（精确至0.01g）于聚四氟乙烯离心管中，加入10mL甲醇溶液，匀浆，12000r/min离心10min，取1mL上清液氮吹至近干，用甲醇∶水 =2∶8定容至1mL，过膜，待仪器使用。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

苹果样品采用甲醇提取，由于赤霉素、甲萘威、脱落酸、多效唑、烯效唑这五种化合物在甲醇中溶解度高，可以保证较好的提取效果。赤霉素溶液一般不稳定，因此在制备样品时应低温振荡提取和保存。本实验通过氮吹的方式，进行富集浓缩，再用甲醇∶水=2∶8定容，较好地排除了基质的干扰，操作简便快速，提高了检测灵敏度和准确性，具备较好的重现性和稳定性。

2.2 液相色谱-质谱条件的选择

赤霉素、甲萘威、脱落酸、多效唑、烯效唑这五种物质极性不同，采用了梯度洗脱的方式。本实验尝试了含有甲酸的水溶液-乙腈、水-乙腈和含有乙酸铵的水溶液-乙腈进行比较，发现含有乙酸铵的水溶液-乙腈的流动相分离的效果好，峰型对称。由于起始流动相中水相多，采用普通的C18色谱柱分离效果不好，经过选择比较，确定用Shield RP18柱进行分析。BEH Shield RP18色谱柱的填料是氨基甲酸酯官能团嵌入键合相的烷基链，应用了“屏蔽”键合相技术和亚乙基桥杂化颗粒技术，可以应用于流动相中含100%水相时使用，具备和C18相结合互补的分离选择性和更好的峰型。

赤霉素、甲萘威、脱落酸、多效唑、烯效唑这五种化合物性质结构各不相同，其中赤霉素和脱落酸的分子中均含有羧基，在电喷雾电离源中易产生［M-H］-离子，因此宜采用负离子模式。经实验证实，赤霉素、脱落酸在电喷雾条件下易产生负离子，甲萘威、多效唑、烯效唑在电喷雾条件下易产生正离子，因此在ESI-电离方式下，针对赤霉素、脱落酸进行了仪器的毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等参数的优化选择；在ESI+电离方式下，针对甲萘威、多效唑、烯效唑进行了仪器的毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等参数的优化选择。液相流动相采用乙腈和含有微量乙酸铵的水溶液，在梯度条件下进行分析。最后确定的梯度方法可以将赤霉素、脱落酸在2.2min内出峰，因此在0～2.2min期间采用ESI-电离方式采集样品，在2.2～6min采用ESI+电离方式下采集甲萘威、多效唑、烯效唑。如图1和图2分别为总离子流图和多反应监测色谱图。

2.3 方法线性范围、测定下限及精密度

本实验中的标准曲线采用对五种生长调节剂的基质进行加标，最后做出加标曲线来进行定量。准确吸取一定量的混标溶液，加入到样品中，样品中含不同浓度梯度的标准品，其中甲萘威、多效唑、烯效唑的浓度梯度为 10、20、40、50ng/mL，赤霉素、脱落酸的浓度梯度 100、200、400、500ng/mL。经过前处理之后，上机检测，得到的加标曲线如图3所示。

选用在苹果空白样品中添加赤霉素、脱落酸的浓度为150!g/kg，甲萘威、多效唑、烯效唑的浓度为15!g/kg，水平重复6次，以S/N≥10计的测定检出限和标准偏差，结果见表3所示。

图1 总离子流图

图2 多反应监测色谱图

表3 精密度实验

图3 甲萘威、赤霉素、烯效唑、多效唑和脱落酸的加标曲线图

3 结论

本研究建立了液质联用检测苹果中的赤霉素、脱落酸、甲萘威、多效唑和烯效唑含量的方法，实验结果表明，该方法操作简单快捷，准确度和稳定性好。

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Determination of gibberellin，abscisic acid，carbaryl，paclobutrazol and uniconazole in apples by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHANG Hui1，WU Ying1，LU Yong2，ZHANG Wei-min2，JIANG Jie2，FENG Nan2，XIE Wen-dong2
（1.Beijing Products Quality Supervision and Inspection Institute，Beijing 100026，China；2.Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring，Beijing 100041，China）

TS255.7

A

1002-0306（2010）10-0383-03

2010-04-08

张慧（1981-），女，助工，研究方向：分析检测。