温度对三叶青组培苗SOD、MDA等指标的影响

钱丽华，阮松林，戴丹丽，忻 雅

(1.浙江省杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024;2.浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

三叶青是葡萄科多年生蔓生藤本植物，分布于浙江、江西、福建等10多个省 (区)，医学临床试验表明具有清热解毒、消肿散结、祛风化痰、活血止痛的功效，可用于治疗小儿高热、扁桃体炎、肝炎及病毒性脑膜炎等多种疾病，也是抗肿瘤常用药物，而且对肝癌和血癌细胞具有“促凋亡作用”。国内关于三叶青药理、抗病机制方面的研究很多，但有关三叶青生理方面的研究罕见报道。三叶青对生长环境要求苛刻、生长速度极其缓慢，野生资源稀少，因人为狂采滥挖，已濒临灭绝，为了保护三叶青野生资源，提高其人工驯化栽培水平，实现三叶青产业化发展，特开展高温、低温等不同温度梯度处理对三叶青试管组培苗生长影响的研究，筛选出三叶青试管组培苗最适生长温度，探究组培苗抗高温和低温逆境能力，以期为三叶青田间驯化栽培管理提供技术参考依据和指导。

1 材料与方法

以三叶青3 cm左右的不定芽为供试材料。将三叶青不定芽接种于继代培养基上，每瓶接种大小一致的不定芽5株，光照培养8 d，不定芽基部愈伤组织膨大，然后在光照培养箱中进行高温和低温处理，每个处理3瓶，处理前称量不定芽原始鲜重，高温处理为30℃，35℃，40℃，45℃ 4个温度，低温处理为10℃和5℃ 2个温度，对照为25℃，高温处理时间为16 h，低温处理时间为24 h，处理后将其转入对照温度下继续培养，1个月后取出称量各处理不定芽鲜重，同时测定超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)、可溶性蛋白等生理指标。

SOD活性测定。取1 g试管组培苗不定芽材料，加入预冷2 mL 25 mmol，pH值7.8的磷酸缓冲液 (含0.2 mmol EDTA、2 mol·L－1抗坏血酸和2%PVP)和少量石英砂粉末，在冰浴中研磨成匀浆，倒入1.5 mL离心管中，于4℃下12 500 r·min－1离心20 min，取上清液转入1.5 mL离心管中，置于4℃备用。将 50 μL上清液和 3 mL NBT反应液 (含50 mmol磷酸缓冲液、13 mmol甲硫氨酸、63 μmol NBT、1.3 mol核黄素和0.1 mol EDTA)，放入10 mL试管中，在25℃下光照30 min。空白以3 mL NBT反应液 +50 μL的缓冲液作本底，用缓冲液调零。以抑制NBT光化还原为1个酶活力单位。

MDA含量测定。取1 g试管组培苗不定芽材料，加入预冷3 mL 50 mmol、pH值7.8磷酸缓冲液 (含2%PVP)和少量石英砂粉末，在冰浴中研磨成匀浆，倒入1.5 mL离心管中，于4℃下12 500 r·min－1离心 20 min，取上清液转入 1.5 mL离心管中，置于4℃备用。取1 mL上清液和3 mL TCA反应液 (0.6%TBA和20%TCA)，放入10 mL试管中，在95℃水浴中保温30 min，然后立即置于冰浴中冷却，在4℃下12 500 r·min－1离心10 min，在532和600 nm波长下测定光密度，按经验公式计算获得MDA含量。

可溶性蛋白含量测定。取0.5 g试管组培苗不定芽材料，加入预冷2 mL 25 mmol、pH值7.8磷酸缓冲液 (含0.2 mmol EDTA、2 mol·L－1抗坏血酸和2%PVP)和少量石英砂粉末，在冰浴中研磨成匀浆，倒入1.5 mL离心管中，于4℃下12 500 r·min－1离心20 min，取上清液转入1.5 mL离心管中，置于4℃备用。取20 μL上清液和3 mL考马斯亮兰 G-250溶液 (0.6%TBA和20%TCA)，放入10 mL试管中，在室温下反应15 min，在595 nm波长下测定光密度。以牛血清 (BSA)为标准对照，计算可溶性蛋白含量。

2 结果与分析

2.1 对鲜重的影响

测定结果 (图1)表明，在高温处理中，30℃、35℃处理后三叶青试管组培苗鲜重增加最明显，平均鲜重增加达到4.402 7～5.149 3 g，两者之间不存在显著差异，但均极显著优于其它4个处理。在25～35℃范围内，随着温度的上升，三叶青试管植株鲜重呈递增趋势，但当温度升至40℃，三叶青试管植株鲜重增加明显减少，且低于其它5个处理，当温度升至45℃时，三叶青试管植株全部黄化死亡。低温处理，随着温度的下降，三叶青试管植株鲜重增加逐渐减少，但两者之间不存在显著差异，与对照之间也不存在显著差异，这有待于进一步分析。因此，我们认为30～35℃是三叶青试管组培苗生长的最适宜温度，而40℃以上或10℃以下温度则不利于三叶青试管组培苗生长。

图1 不同温度处理后三叶青试管组培苗鲜重变化

2.2 对SOD酶活性的影响

25～35℃温度范围内，随着温度的上升，三叶青试管组培苗SOD酶活性逐渐上升，在35℃时达到最高 (图2)，当温度上升至40℃时，SOD酶活性快速下降至最低;低温5℃或10℃处理后，三叶青试管组培苗SOD酶活性均低于对照，两者之间不存在显著差异。由此可见，35℃时SOD酶活性最高，而40℃时SOD酶活性则最低。

图2 温度处理三叶青组培苗SOD酶活性的变化

2.3 对MDA含量的影响

从图3看出，25～35℃范围内，随着温度的上升，MDA呈下降趋势，35℃时三叶青试管组培苗的MDA含量降至最低，当温度升至40℃，三叶青试管组培苗中MDA含量大幅增加，明显高于其它各处理，30℃处理后三叶青试管组培苗中MDA含量与对照基本一致;低温处理中，5℃下三叶青组培苗中MDA含量高于对照，而10℃下MDA含量低于对照，这有待于进一步分析。由此可见，40℃下 MDA含量最高，其次为5℃，而35℃时MDA含量则最低。

图3 温度处理三叶青组培苗MDA含量的变化

2.4 对可溶性蛋白含量的影响

25～35℃范围内，随着温度上升，可溶性蛋白含量也随之升高，且以35℃时可溶性蛋白含量最高，当温度升至40℃时，可溶性蛋白明显下降(图4);5℃，10℃低温处理后三叶青试管组培苗可溶性蛋白含量均高于对照。由此可见35℃及10℃以下都引起植株可溶性蛋白含量的增加，而40℃以上则引起可溶性蛋白含量的下降。

图4 温度处理三叶青组培苗可溶性蛋白含量的变化

3 小结与讨论

30～35℃是三叶青试管组培苗生长的最适宜温度，平均鲜重增加达到4.402 7～5.149 3 g;而40℃以上或10℃以下温度则不利于三叶青试管组培苗生长，植株生长缓慢，鲜重变化小。

SOD酶含量随温度上升而上升，在35℃时达到最高，这主要是由于在温度胁迫下，植物会通过调节自身的防御体系对温度胁迫作出适应性反应［1］，导致SOD酶活性上升，而40℃以上或10℃以下温度处理后SOD酶含量明显较其它处理低，这可能是由于此时温度胁迫已经超过了三叶青机体的耐受能力，无法清除体内过多的活性氧，SOD酶活性下降，膜修复能力减弱，植株生长缓慢。

MDA是膜系统受害的一个重要标志之一［2］。5℃和40℃处理后MDA含量明显较其它处理高，这可能是由于高低温逆境下，三叶青试管苗细胞膜脂发生了过氧化，产生了植物细胞膜脂过氧化的产物MDA，从而对膜造成严重伤害。

一般认为可溶性蛋白含量与植物的抗冷性之间存在密切关系。在逆境胁迫条件下，植物可溶性蛋白含量会增加，由于它的亲水胶体性质强，能增加细胞持水性，因此可减少原生质因结冰而伤害致死的可能性［3］。试验中5～10℃低温胁迫可能诱导了低温相关蛋白表达，植株产生抗冷应急反应，引起可溶性蛋白含量明显增加;35℃温度时可溶性蛋白含量最高，这可能与三叶青生长相关蛋白的增加有关;40℃温度抑制了三叶青试管组培苗生长，可溶性蛋白含量有所下降，可能与高温胁迫下蛋白质合成受阻或发生降解有关，杨华庚等［4］对蝴蝶兰幼苗进行高温胁迫试验中，也发现高温胁迫下蛋白质含量在下降，推测与蛋白质合成受阻或降解有关。

试验结果表明，三叶青栽培中生长温度为30～35℃时，有利于幼苗地上部生长;当温度降至10℃以下或升至40℃以上时，则需考虑做好保温或降温措施。

［1］罗娅，汤浩茹，张勇.低温胁迫对草莓叶片 SOD和 ASAGSH循环酶系统的影响［J］.园艺学报，2007，34(6):1405－1410.

［2］陈少裕.膜脂过氧化对植物细胞的伤害［J］.植物生理学通讯，1991，27(2):84－90.

［3］江福英，李延，翁伯琦.植物低温胁迫及其抗性生理［J］.福建农业学报，2002，17(3):190－195.

［4］杨华庚，陈慧娟.高温胁迫对蝴蝶兰幼苗叶片形态和生理特性的影响［J］.中国农学通报，2009，25(1):123－127.