ERCC1基因多态性与晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗疗效的关系

王敬慧 张权 张卉 王群慧 杨新杰 顾艳斐 张树才

肺癌居癌症相关死亡病因的首位，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）约占肺癌的80%，2/3的患者确诊时已为晚期。含铂两药化疗方案是NSCLC的标准一线治疗，客观缓解率约为30%-40%，中位生存期为8个月-10个月，1年生存率为30%-40%。顺铂是肺癌化疗方案的基本药物之一，通过与DNA形成交联复合物抑制DNA合成和转录，从而起到抗肿瘤的作用。切除修复交叉互补组1（excision repair cross-complementing group 1, ERCC1）是核苷酸切除修复途径的重要成分，通过对铂类-DNA复合物的切除修复而影响铂类药物的疗效。研究显示ERCC1 C8092A和第118位密码子位点单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism, SNP）在预测晚期NSCLC患者铂类化疗疗效方面有一定的价值，但研究结果仍存在争议。本研究通过对晚期NSCLC患者化疗前外周血基因组ERCC1 C8092A、118密码子基因型进行分型，探讨C8092A、密码子118多态性与含铂化疗疗效的关系，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2008年5月-2009 年 5月期间在北京胸科医院肿瘤内科经细胞学或组织学确诊的晚期NSCLC初治患者90例：中位年龄55岁（33岁-73岁）；男性63例，女性27例；腺癌69例，鳞癌20例，腺鳞癌1例；IIIb期30例，IV期60例。全部患者均接受含顺铂两药方案化疗，中位化疗周期数为4周期。方案：顺铂/紫杉醇40例、顺铂/长春瑞滨7例、顺铂/吉西他滨36例、顺铂/培美曲噻7例，随访日期截至2009年7月31日，77例患者出现疾病进展，其余13例未进展。

1.2 实验方法 DNA提取，化疗前采用EDTA抗凝负压管抽取静脉血标本3 mL-5 mL，Miller法提取外周血基因组DNA。引物序列：C8092A：上游引物5’-ACAGT GCCCCAAGAGGAGAT-3’，下游引物5’-AGTCTCTGG GGAGGGATTCT-3’，扩增产物204 bp；ERCC1 118：上游引物5’-CCAGAACACTGGGACAT-3’，下游引物5’-TCAGAGGATCAGGGACT-3’，扩增产物399 bp。引物由北京赛百盛生物公司合成。PCR反应条件：C8092A：95oC、5 min，95oC、30 s，59oC、30 s，72oC、45 s，35个循环，72oC、10 min；ERCC1 118：95oC、5 min，95oC、30 s，54oC、30 s，72oC、45 s，35个循环，72oC、10 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳后经紫外凝胶成像系统拍照。将有阳性结果的PCR产物进行测序，应用Bioedit软件对测序结果与ERCC1基因组序列进行比对，确认ERCC1基因C8092A、118位点基因型，测序由北京天根生化科技有限公司完成。

1.3 疗效评价及生存记录 按RECIST标准进行疗效评价：完全缓解（complete response, CR）：所有目标病灶消失且持续4周；部分缓解（partial response, PR）：肿瘤最大径之和至少减少30%，并保持4周以上；疾病进展（progressive disease, PD）：基线病灶长径总和增加≥20%或出现新病灶；病灶稳定（stable disease, SD）：缩小未达PR或增加未到PD；CR和PR者需经4周后确认。参考国内外同类研究，设定CR+PR为有效，SD+PD为无效。以进入研究起始时间为起点，疾病进展时间作为终点记录患者无进展生存期（progression free survival, PFS）。对于在随访截止日期无进展的病例，在统计时作为删失数据处理。

1.4 统计处理 采用SPSS 10.0进行数据处理。率的比较采用χ2检验和Fisher's精确概率检验进行分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，各因素水平间比较用Log-rank分析，Cox回归模型分析预后相关因素。所有统计检验均为双侧概率检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERCC1 C8092A、118基因型频率 90例晚期NSCLC患者ERCC1 C8092A位点存在3种等位基因型，基因频率分别为：CC 40.0%（36/90）、CA 48.9%（44/90）、AA 11.1%（10/90）；ERCC1 118存在3种等位基因型，基因频率分别为：CC 58.9%（53/90）、CT 34.4%（31/90）、TT 6.7%（6/90）。不同年龄、性别、吸烟状况、病理类型、临床分期患者间ERCC1 C8092A、118多态性均无统计学差异（P＞0.05）。

2.2 ERCC1 C8092A、118多态性与疗效的相关性 90例晚期NSCLC患者经疗效评价后，0例CR，27例（30.0%）PR，50例（55.6%）SD，13例（14.4%）PD，总有效率（CR+PR）为30.0%。ERCC1 C8092A CC基因型患者化疗有效12例，无效24例，CA+AA基因型化疗有效16例，无效38例，CC和CA+AA患者疗效间无统计学差异（P=0.71）。ERCC1 118 CC基因型化疗有效17例，无效36例，CT+TT基因型患者化疗有效9例，无效28例，CC和CT+TT患者疗效间无统计学差异（P=0.43）（表1）。C8092A、118多态联合分析显示，ERCC1两个位点同为CC基因型患者疗效与其它基因型患者比较无统计学差异（P=0.12）（表2）。

2.3 ERCC1 C8092A、118多态性与PFS的相关性 ERCC1 C8092A CC基因型患者的中位PFS为5.2个月，CA或AA基因型患者的中位PFS为5.4个月，Log-rank分析无统计学差异（P=0.62）（图1A）；ERCC1 118 CC基因型患者中位PFS为5.5个月，CT或TT基因型患者中位PFS为5.3个月，Log-rank分析无统计学差异（P=0.59）（图1B）；ERCC1 C8092A、118联合多态性与PFS无关（P=0.42）。经Cox回归多因素分析，ERCC1 C8092A、118多态性均不是晚期NSCLC患者PFS的独立因素。

表1 晚期NSCLC患者ERCC1 C8092A、118多态性与含铂化疗疗效的关系Tab 1 Genotype frequencies in patients with advanced NSCLC and response to cisplatin-based chemotherapy according to genotype

表2 晚期NSCLC患者ERCC1 C8092A、118多态联合与含铂化疗疗效的关系Tab 2 Genotype frequencies in patients with advanced NSCLC and response to cisplatin-based chemotherapy according to combination of genotype in C8092A and 118

3 讨论

SNP是基因水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基转换、颠换以及单碱基插入或缺失等形式，是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。基因序列中单个碱基的变异引起编码的氨基酸发生改变，从而影响基因表达的蛋白质的功能。SNP与许多疾病的易感性及治疗疗效等相关。DNA修复基因包括核苷酸切除修复基因、碱基切除修复基因、DNA链断裂修复基因、错配修复基因和直接逆转损伤的修复基因等。DNA修复能力是影响铂类疗效的重要原因，其中核苷酸切除修复与铂类药物耐药最为密切，ERCC1基因在核苷酸切除修复途径中起重要作用[1]。C8092A和第118位密码子是ERCC1基因多态性被研究最为广泛的两个位点。C8092A位于ERCC1基因的3’非编码区，可能与ERCC1 mRNA翻译有关。ERCC1第118位密码子基因C型变异为T型，核苷酸序列由AAC变为AAT，虽然没有导致氨基酸的替代，生成的仍为天冬酰胺，但会影响ERCC1 mRNA和蛋白水平及/或导致与其它功能性SNPs的连锁不平衡，使个体对铂类药物的敏感性产生差异，影响铂类药物疗效[2]。Park等[3]证明ERCC1 118 C变异为T，CT或TT等位基因使ERCCl mRNA水平增高，DNA修复能力增强，患者对铂类药物的敏感性降低，野生型基因（CC）患者对含铂化疗更敏感。

图1 ERCC1 C8092A（A）和118（B）各基因型PFS比较Fig 1 Kaplan-Meier curves of PFS according to ERCC1 C8092A (A) and 118 (B)genotypePFS: progression free survival.

本文前瞻性研究90例EERCC1基因C8092A、第118位密码子多态性能否预测接受含铂化疗晚期NSCLC患者的疗效，结果发现，90例晚期NSCLC患者ERCC1基因C8092A三种基因型频率分别为40.0%（CC）、48.9%（CA）、11.1%（AA），第118位密码子的三种基因型频率分别为 58.9%（CC）、34.4%（CT）、 6.7%（TT），两种基因型多态性在不同年龄、性别、吸烟状况、病理类型、临床分期间均无统计学差异。本文结果显示，C8092A各基因型有效率相近，118密码子CC基因型有效率高于CT及TT基因型，但二者多态性与疗效均无统计学差异。ERCC1 C8092A和118各基因型的PFS相近，两个位点多态性与PFS均无相关性。多态性联合分析结果提示两个位点同时为CC基因型的有效率达46.7%，明显高于其它基因型组合，但无统计学差异，值得扩大样本进一步研究。

国内袁芃等[4]检测了200例接受含铂方案化疗的晚期NSCLC患者ERCC1基因C8092A多态性，多态性与疗效（CR+PR与SD+PD比较）不相关。柳艳飞等[5]报告94例接受紫杉醇联合顺铂化疗的晚期NSCLC患者第118位密码子各基因型与临床受益率及1年生存率差异均无统计学意义。高长明等[6]报告57例接受吉西他滨联合顺铂化疗的晚期NSCLC患者的第118位密码子CC基因型疗效高于CT基因型（有效率分别为46.4%、23.1%），但无统计学差异。意大利作者Tabldi等[7]报告，65例接受顺铂联合吉西他滨治疗的晚期初治NSCLC患者的118多态性与疗效及预后不相关。西班牙Delas等[8]报告，135例接受顺铂、吉西他滨化疗的晚期NSCLC患者118多态性与患者的预后无关。但也有不同的研究结果。Zhou等[9]研究了128例接受含铂方案化疗NSCLC患者ERCC1基因C8092A 位点的多态性，发现CC基因型患者MST为22.3个月，CA和AA基因型患者MST为13.4个月（P=0.006）。Su等[10]对76例接受含铂化疗的晚期NSCLC患者研究时发现，ERCC1 118 CC基因型与化疗疗效显著相关，比含T（TT+CT）等位基因患者化疗的有效率高（OR=4.10, 95%CI 1.31-12.85）。韩国Ryu等[11]研究发现109例晚期NSCLC接受含顺铂联合方案化疗患者118密码子各基因型间的疗效无差异，但CC基因型患者的生存期显著长于TT或CT基因型患者（MST分别为486天和281天，P=0.005 8）。西班牙Isla等[12]报告，62例多西紫杉醇联合顺铂治疗的晚期NSCLC患者118密码子CC基因型的预后显著优于CT或TT基因型患者。希腊Kalikaki等[13]报告接受含铂化疗的晚期NSCLC患者ERCC1基因C8092A多态性与生存显著相关，CA或AA基因型患者生存期显著优于CC基因型（MST分别为9.8个月和14.1个月，P=0.009），118密码子多态性与疗效（CR+PR与SD+PD比较）相关，含C基因型患者（CC、CT）有效率显著高于TT基因型（P=0.012）。

各研究结果的不一致可能受入组病例数、化疗方案、基因型检测方法等因素影响，也与不同种族基因型频率分布显著不同有关[14]。ERCC1基因多态性影响晚期NSCLC患者铂类化疗疗效及生存期的机制尚未完全阐明，如果将ERCC1 mRNA以及蛋白表达共同融合到ERCC1 C8092A、118密码子基因多态性研究中，探讨其相互影响的机制，可能有助于阐明ERCC1多态性对基因转录和蛋白质翻译的作用。ERCC1基因多态性能否为个体化治疗提供选择药物的依据，还需要进行更大样本更严谨的临床研究来明确RCC1基因多态性对晚期NSCLC患者含铂化疗疗效及生存的作用。

本试验样本量不是非常大，化疗方案较多，可能对结果有些影响。因本组患者随访期不长，本文仅对ERCC1多态性与PFS的关系作了探讨，尚不能进行ERCC1多态性预测患者生存期的分析，我们将继续对全组患者进行随访，并在今后对ERCC1基因多态性与晚期NSCLC患者生存的关系作出评价。