酶解蛋清粉制备蛋清蛋白肽工艺条件研究

张治国，王君虹，陈新峰，周利亘，冯凤琴

(1.浙江省农业科学院食品加工研究所，浙江 杭州 310021;2.浙江大学食品科学与营养系，浙江 杭州 310029)

蛋清粉是一种资源丰富、价格低廉的优质蛋白资源。蛋清粉腥味重、溶解性差、粘度大、受热易凝固，这些性质限制了它在食品加工中的应用。蛋白酶解技术可使蛋白质部分降解，从而使其溶解性提高、粘度和热凝固性降低，并可促使呈味氨基酸或小肽释放，改善其风味［1］。此外，蛋白质酶解后产生的小肽比大分子蛋白质更易吸收，并能产生抗氧化、降血脂、降血压等生理活性小分子肽［2－6］。因此，利用酶解技术对蛋清粉进行部分降解，可制备出既可满足食品加工业需求，又具有有益生理活性的蛋清蛋白肽。郑云［7］通过正交试验研究了中性蛋白酶酶解蛋清蛋白，制备蛋清蛋白肽的工艺。本研究以蛋清粉为原料，探讨碱性蛋白酶催化酶解蛋清粉，制备蛋清蛋白肽的工艺条件，以期为蛋清粉的深加工利用奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

蛋清粉，粗蛋白含量83.37%，购自大连绿雪蛋品发展有限公司。碱性蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公司。该酶由地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)2709发酵而来，酶活为200 000 U·g－1，最适酶解条件为 50～55℃，pH 值 8.0～8.5。

仪器有离心机、HH-4数显恒温水浴锅、pHS-3C精密pH计等。

1.2 方法

配制5%蛋清粉溶液作为底物溶液，按照实验设计调节底物溶液的pH值，在设定温度的水浴锅中温育10 min后，加入设定量的酶进行酶解，酶解时间为所设计时间。水解过程中水浴控温，每30 min震荡混匀1次，并滴加浓氢氧化钠溶液，使底物溶液的pH值维持在设定值。

水解结束后，按陈新峰等［8］的方法测可溶性肽含量，计算水解度 (DH)。

单因素实验结果用Office EXCEL软件包作图。正交试验结果采用SPSS 16.0 GLM中单变量方差分析程序处理，p<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 水解时间对水解度的影响

5%蛋清粉溶液，pH值8.0，温度为50℃，加酶量为5 000 U·g－1蛋清粉，分别水解不同时间，测定水解度。结果表明，随着水解时间的延长，水解度不断上升。但水解5 h后，水解度上升幅度很小 (图1中a)。因此，确定5 h为较优水解时间。

2.2 底物溶液pH对水解度的影响

5%蛋清粉溶液，温度50℃，加酶量5 000 U·g－1蛋清粉，分别在不同 pH条件下水解5 h，测定水解度。结果表明，pH值8.5时水解度最高(图1中b)。由此，确定pH 8.5为较优底物溶液pH值。

2.3 加酶量对水解度的影响

图1 水解时间 (a)、底物溶液pH(b)、加酶量 (c)和酶解温度 (d)对水解度的影响

5%蛋清粉溶液，pH值8.5，温度50℃，分别在不同加酶量的条件下水解5 h，测定水解度。结果表明，在加酶量为4 000～8 000 U·g－1蛋清粉的范围内，水解度随加酶量的增加而逐渐升高。加酶量超过6 500 U·g－1时，水解度增幅很小 (图1中c)。考虑到酶是导致工艺成本增加的主要因素之一，确定6 500 U·g－1为较优加酶量。

2.4 酶解温度对水解度的影响

5%蛋清粉溶液，pH值8.5，加酶量为6 500 U·g－1蛋清粉，分别在不同温度下酶解5 h，测定水解度。结果表明，以55℃条件下酶解的水解度最高 (图 1中 d)。因此确定55℃为较优酶解温度。

2.5 蛋清粉酶解工艺的优化

根据上述结果，确定水解时间、底物溶液pH、加酶量和酶解温度的水平 (表1)。采用正交表L9(34)设计正交实验，对蛋清粉酶解工艺条件进行优化，实验结果见表2。

表1 正交实验的因素与水平

极差分析及方差分析结果 (表2)表明，各因素对水解度的影响大小依次为:C>D>B>A，其中因素C对水解度的影响显著 (F=28.92*)。比较各因素的均值 (k1至k3)，确定碱性蛋白酶水解蛋清粉的最优工艺条件为:A3B2C3D2，即水解6 h、底物溶液pH为8.5、加酶量7 000 U·g－1、酶解温度为55℃。由于水解5 h后，延长水解时间并不会引起水解度的大幅度升高 (图1中a及表2)，而且，延长水解时间增加能耗，导致工艺成本增加，因此，确定A2B2C3D2为较优酶解工艺。

表2 蛋清粉酶解工艺优化的正交实验结果

2.6 结果验证

对A3B2C2D3和A3B2C2D2进行验证实验，计算水解度。结果表明，这2种工艺条件均可较好地实现对蛋清蛋白的水解，其水解度分别达到84.18%和83.16%。由此可见，当底物溶液pH为8.5、加酶量7 000 U·g－1、温度55℃时，水解时间缩短为5 h也可获得好的水解度 (表3)。因此，确定A3B2C2D2为较优水解工艺条件。

表3 2种工艺条件的水解度结果

3 小结和讨论

本研究未考察蛋清粉浓度对水解度的影响，因为预备实验结果表明，5%的蛋清粉溶液稳定性较好，高于此浓度时，蛋清粉溶液易形成凝块;低于此浓度时，所得蛋清蛋白肽溶液含量低，不利于后期喷雾干燥。此外，杜永盛［9］观察了不同浓度的咸蛋清对蛋清蛋白水解度的影响，证实底物溶液的蛋白浓度为4.5%时，蛋清蛋白的水解度最高。这一浓度与本研究蛋清粉溶液中蛋白浓度接近。

郑云［7］观察了多种酶对蛋清蛋白的水解能力，认为中性蛋白酶的水解能力较好，碱性蛋白酶较差。通过正交实验优化后，中性蛋白酶的水解度可达到80.8%。本研究选用地衣芽孢杆菌2709发酵产生的碱性蛋白酶，经正交实验优化酶解工艺后，其对蛋清蛋白的酶解能力优于中性蛋白酶。这一结果表明，地衣芽孢杆菌2709发酵产生的碱性蛋白酶是一种适宜于蛋清蛋白酶解的酶。不同研究中碱性蛋白酶水解能力的差异可能是由于酶的发酵菌株不同，酶的剪切位点差异造成的。

此外，本研究虽优化出了碱性蛋白酶催化酶解蛋清粉的工艺条件，并得到较高的水解度，但酶添加量较高。因此，可利用各种蛋白酶水解能力互补的特性，进一步研究蛋清粉的多酶联合水解工艺，以降低工艺中酶的成本，并进一步提高蛋清粉的水解度。

［1］Vioque J，Sánchez-Vioque R，Clemente A，et al.Partially hydrolyzed rapeseed protein isolates with improved functional properties ［J］.Journal of the American Oil Chemists＇Society，2000，77(4):447－450.

［2］周利亘，陈新峰，王君虹，等.乳源酪蛋白肽脱色工艺条件的研究 ［J］.浙江农业学报，2007，19(2):75－79.

［3］于国平.乳蛋白质中的生物活性肽 ［J］.中国乳品工业，1997，25(2):32－33.

［4］陈帅，左爱仁，范青生.牛乳蛋白酶水解特性研究 ［J］.食品工业，2003(6):49－51.

［5］顾瑞霞.乳与乳制品的生理功能特征 ［M］.北京:中国轻工业出版社，2000:50－60.

［6］周利亘，王君虹，陈新峰，等.三酶复合法提取大豆多肽工艺的研究 ［J］.浙江农业学报，2006，18(4):241－245.

［7］郑云.蛋清蛋白肽生产工艺的研究 ［D］.北京:北京化工大学，2006.

［8］陈新峰，王君虹，洪狄俊，等.木瓜蛋白酶水解制备乳酪蛋白肽工艺条件的研究 ［J］.浙江农业学报，2008，20(2):123－126.

［9］杜永盛.酶解咸鸭蛋蛋清制取白蛋白肽的研究 ［D］.杭州:浙江大学，2006.