利用SRAP分析东北地区甜菜品系遗传多样性

王茂芊 ，吴则东 ，陈 丽 ，王华忠

（1.内蒙古农业大学，呼和浩特 010018；2.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室，哈尔滨150080；3.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室/中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150080）

甜菜是我国重要的糖料作物之一，已经确立为黑龙江省的主要农作物。但由于中国不是甜菜起源国，缺少种质资源，遗传基础狭窄，而且我国的甜菜育种多数仍然依赖于植株表型性状的选择及一些生理生化指标的测定，很少从分子标记的遗传层面进行深入研究，致使育种水平提高缓慢。为了培育出适合黑龙江省的更为高产、抗病、高糖的甜菜新品种，避免遗传基础过于狭窄可能造成的危害，有必要对东北地区的甜菜资源进行亲缘关系和遗传多样性分析。近年来，我国有关甜菜的遗传多样性和分子标记育种的研究已有所进展。路运才等[1]利用RAPD分子标记技术对我国的15个甜菜多倍体品种，于歆等[2]应用AFLP技术对甜菜双丰系列的8个品种分别研究表明，我国甜菜的遗传材料基础狭窄。田自华等[3-4]对甜菜细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体DNA和叶绿体DNA进行RAPD分析表明，甜菜不育系和保持系的叶绿体DNA之间不存在差异，而在线粒体DNA之间存在丰富的多态性。目前分子标记技术主要包括AFLP、RFLP、SRAP、SSR、RAPD、ISSR等标记方法[5-7]。SRAP（sequence-related amplified polymorphism）即相关序列扩增多态性，又叫基于序列扩增多态性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP），近几年应用比较广泛。SRAP标记在中国已成功应用于棉花[8-9]、西瓜[10]、油菜[11]、莲藕[12]、甘薯[13]和野牛草等植物[7]。 但利用 SRAP分析甜菜的并不多，选用的引物也较少。王华忠等[14-15]应用SRAP分子标记分析了49个甜菜材料的遗传多样性，并对SRAP引物组合进行了筛选以及甜菜SRAP-PCR反应体系进行了优化。本试验对94份东北地区甜菜品系材料和6个国外品种进行SRAP分子标记分析，从88对引物组合中筛选出有效引物组合33对，可以有效地对甜菜进行分子标记分类和亲缘关系分析，为指导种质资源引进，杂交组合亲本选择和分子标记辅助选择育种等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验参试材料共100份(见表1)，其中多胚二倍体品系48份，多胚四倍体品系35份，单胚雄性不育系和保持系11份，另有6份外国品种作对照。均为中国农业科学院甜菜研究所选育或引进的代表性材料。

1.2 方法

田间鉴定试验与生物学性状调查在中国农业科学院甜菜研究所进行，SRAP分子标记分析在黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室进行。

1.2.1 田间鉴定试验与生物学性状调查 2008年4月25日，在中国农科院甜菜研究所试验地种植不同类型甜菜品系100份，随机区组排列，4次重复，2行区，行长10 m，株距25 cm。利用国际通用的Beta属鉴定性状的形态指标及褐斑病病情进行调查，收获时测定根产量，调查根腐病株数，收获后2～3 d检测含糖率。每个材料按常规调查30株，计算平均数。经济性状主要概括为如下6种类型：高产高糖高抗型、高产高糖中抗型、高产中糖低抗型、高产中糖中抗型、高产低糖低抗型、中产高糖高抗型。

1.2.2 基因组DNA的提取 基因组DNA的提取采用改良CTAB法[16]，提取的DNA质量和浓度采用1%琼脂糖凝胶电泳检测（每孔加样为 1μL 样品 DNA、4μL ddH2O、1μL 6×Loading Buffer）。 样品稀释到 10 ng/μL，置-20℃冰箱中保存。

1.2.3 SRAP-PCR体系 在20μL SRAP-PCR体系中含2.5 mmol/L的dNTPs 1.6μL，1 U Taq DNA聚合酶，上下游引物各60 ng，模板DNA 40 ng，用重蒸水调整体系使终体积为20μL。反应程序为94℃预变性3 min；94℃l min，35℃l min，72℃l min 5个循环，随后的35个循环复性温度提高到50℃，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.4 电泳分析检测 本试验的PCR产物分别采用了BioRAD公司生产的电泳仪及电泳槽和北京六一厂生产的DYC-30电泳槽，电泳缓冲液均为1倍 TBE。前者6%变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳时，先在70 W恒功率下预电泳30 min，然后把上样孔中的气泡充分驱逐干净，点样前取扩增产物4 μL加2 μL 10倍上样缓冲液（47.5 mL甲酰胺、2.0 mL 0.5 M EDTA、溴酚蓝0.125 g，定容到50 mL）混匀在PCR仪上95℃变性处理5 min，上样后用70 W恒功率，时间大约70 min。当溴酚蓝到达垂直板底部时，将胶剥下，按如下顺序进行显色：将长板放入2 L 10%的醋酸溶液中，轻轻摇动30 min；蒸馏水中漂洗2次，每次3 min；染色（在2 L蒸馏水中加入2 g硝酸银，3 mL甲醛）30 min；染色完毕后在蒸馏水中迅速漂洗3～4 s，转入预冷的碳酸钠溶液中（其中含有3 mL甲醛，400 μL 10 mg/L的硫代硫酸钠），在摇床上显影至条带清晰为止。后者8%变性聚丙烯酰胺凝胶分离，点样前取扩增产物4μL加双色指示剂2μL混合（离心），每孔点样5μL，上样后调至100～160V大约2h将胶剥下按如下顺序显色：将胶置于100mL固定液中（10%无水乙醇，0.5%冰乙酸），脱色摇床上缓慢摇动 6min，2次；倒去固定液，加入100mL 0.2%AgNO3溶液，脱色摇床上缓慢摇动 12min；倒去AgNO3溶液，用100mL ddH2O清洗30s；加入0.002%硫代硫酸钠100mL，脱色摇床上缓慢摇动30s后倒去；加入100mL显色液（1.5%氢氧化钠，0.4%甲醛），脱色摇床上缓慢摇动至肉眼看到清晰的DNA条带；用清水将胶清洗数次；保鲜膜包好，读条带。

1.2.5 引物筛选 用4个有代表性的品系(27、51、70、95)对88对SRAP标记组合（表2）进行筛选。用多态性好、易于区分的引物组合进行检测。

表1 供试材料及其主要特性

1.2.6 遗传多样性分析 用筛选到的33对SRAP引物组合对100份材料的DNA样品进行PCR扩增。将电泳图谱上清晰出现的条带记为“1”，同一位置无条带记为“0”，获得“0”和“1”组成的原始矩阵后，转化为mega的标准格式，进行聚类分析。按Nei和Li等的方法，遗传相似系数GS=2X12/（X1+X2），遗传距离GD=-lnGS。其中X1、X2分别为成对比较的2个品种的扩增带数，X12为共有带数。利用Mega3.1软件分析，采用非加权类平均法构建聚类图。重复运算1000次后获得自展值(Boot-strap)，以百分数值表示。利用软件中的Compute over-all mean计算组内品种间平均遗传距离，用LSD法[14]检验遗传距离及相似性的差异显著性。

表2 SRAP引物序列与名称

2 结果与分析

2.1 生物学和经济学性状分类

根据材料的主要性状和田间鉴定结果（表1），以经济学性状分类，依据根产量、含糖率、抗病性分为6类，分别为高产高糖高抗型、高产高糖中抗型、高产中糖低抗型、高产中糖中抗型、高产低糖低抗型、中产高糖高抗型。一般而言，单胚雄性不育系和保持系以及杂交改良品系表现为高产、低糖、低抗，多胚二倍体品系表现为中产、高糖、高抗，多胚四倍体品系表现为高产、高糖、高抗，国外品种表现为高产、低糖、低抗，但是具有抗丛根病特性。

2.2 SRAP分子标记的多态性分析

使用4个表型差异比较明显的甜菜品系对88对SRAP引物组合进行扩增，共筛选出SRAP引物组合33对。SRAP标记的多态性见表3，每对引物组合产生16～28条扩增带，33对引物组合共产生694条扩增带，其中有424条呈多态性，平均每个引物组合产生21.0条扩增带和12.8条多态性条带，多态性条带比率平均为61.0%。从结果上看，筛选出的33对引物在100份甜菜材料上均产生了数量不等的特异性条带，多态性较丰富，较好地显示了该作物的遗传多样性。东北材料与外国材料相比较，外国材料的扩增条带只有8～12条，而东北材料有16～28条之多，显著多于外国材料。这表明东北材料与外国材料之间确实存在较大差异，有可能东北材料的基因组成比较复杂，有许多不良基因影响产量的表现。

表3 SRAP引物组合、扩增带数及多态性带数

2.3 遗传距离与遗传相似性分析

利用33对SRAP引物组合产生的694条DNA片段计算94份材料的平均遗传距离为0.3636，平均遗传相似系数为0.6952。单胚不育系和保持系的遗传距离的变动幅度及平均遗传距离最小，而平均遗传相似系数最大，如编号25和26二者遗传距离在单胚品系中最小0.1121，遗传相似系数最大0.8940，因二者是一对同型的单胚不育系和保持系。多胚二倍体品系中，编号44和48遗传距离较小0.1724，遗传相似系数为0.8416，可能是由于二者亲本来源相同。在多胚四倍体品系中编号91和94遗传距离最小为0.1379，遗传相似系数最大为0.8712，可能是由于来源于相近的诱变源所致。而编号70和79遗传距离最大0.4052，遗传相似系数最小0.6668，说明二者遗传基础较远。在国外品种中，编号95和96遗传距离最小0.0690，遗传相似系数最大0.9333，可能二者来源基本相同。以上分析显示了各类型材料之间的亲缘关系和遗传基础不同。从遗传相似系数平均值可见，国外引进品种0.8642>单胚品系0.7910>多胚四倍体品系0.7497>多胚二倍体品系0.7101。说明国外品种的性状整齐，均属于高产低糖抗丛根病型。相比之下，由于国产单胚品系、多胚二倍体和四倍体品系数量较多，遗传基础不同，基因组成比较复杂，所以遗传相似系数相对较小。

2.4 聚类分析

按照UPGMA方法进行聚类分析，得到100份甜菜材料的SRAP聚类图（图1），在遗传距离0.20处，可将参试材料分为四大类群，分别为高产低糖低抗型品系、中产高糖高抗型品系、高产高糖高抗型品系、高产低糖抗丛根病型的品系和外国品种。较好地显示了甜菜材料丰富的遗传多样性和遗传基础的差异性。第一类群有 48 个材料 （图 1 中从上至下的顺序）， 编号为 2、3、22、18、16、27、28、25、26、23、24、12、13、21、29、31、38、36、11、30、37、42、51、55、19、43、8、40、4、6、7、14、32、47、44、48、34、49、83、5、9、1、75、17、33、15、20、68， 其中包括全部的单胚品系、2个多胚四倍体品系和大部分多胚二倍体品系，高产低糖低抗型占同类型总数的77%。第二类群有22个材料，编号为10、58、87、59、79、84、91、94、73、92、50、78、66、77、70、71、89、69、74、72、61、76，其中包括 4 个多胚二倍体品系和18个多胚四倍体品系，中产高糖高抗型占68%。第三类群有20个材料，编号为67、90、54、80、60、64、62、63、65、88、81、85、86、82、93、52、53、56、57、41，包括 6 个多胚二倍体品系和14个多胚四倍体品系，其中75%为高产高糖高抗型。第四类群有10个材料，编 号 为 35、39、45、46、98、100、99、97、95、96，包括4个多胚二倍体品系和6个外国引进品种，其中高产低糖抗丛根病型占60%。分析可见，聚类结果与材料的生物学和经济学性状分类基本吻合，其中具有相近亲缘关系的材料首先聚到一起，如同型的单胚不育系和保持系 25号（JV834-2）和 26 号（JV34-2）二者遗传距离在单胚品系中最小0.1121，遗传相似系数最大0.8940，同型的单胚不育系和保持系23和24聚合到一起，遗传距离为0.1466，遗传相似系数为0.8636。由聚类图可见，国外引进品种聚类到一起，可能是由于参试的外国材料数量较少，而且性状比较整齐，扩增条带只有8～12条。只有4个东北材料与外国材料聚类到一起，可能是这几个东北材料是外国引进品种改良杂交而成，遗传基础相近之故。

3 讨论

本次试验的创新点在于，选用的材料较多，样本更加齐全，引物数量比以往增加较多，多态性较高，其中正向引物8个，反向引物11个，引物组合88对，筛选出可用引物数量多达33对，更有利于正确评价甜菜种质资源的遗传多样性和遗传基础，为育种亲本选配和资源引进提供理论基础和科学依据。试验结果表明，SRAP分子标记将参试材料分成四大类，与田间经济性状鉴定及生物学调查结果基本相符。说明利用SRAP标记能够有效地进行甜菜品种的分子标记鉴定以及不同材料间的亲缘关系和遗传多样性分析。但是，试验中也发现了表现比较特殊的情况，如从聚类图来看，只有4个甜菜品系和外国品种归为一类，可能是由外国品种杂交改良而成，遗传基础相近。从SRAP扩增条带显示来看，外国材料的多态性条带只有8～12条，东北材料有16～28条之多，显著多于外国材料，表明东北材料与外国材料之间确实存在较大差异，东北材料中缺少丰产基因型，这可能是由于中国材料的基因组成比较复杂，许多不良基因影响产量的表现。由聚类图谱分析，有些二倍体和四倍体被聚合到一类，这可能是因其具有一定亲缘关系或经济学性状相似所致。国外引进品种聚类到一起，可能是由于参试的外国材料数量较少，性状比较整齐，而且高产性状突出，且抗丛根病所致。试验表明，只有通过现代分子生物学技术对我国的甜菜种质资源进行详细的分类和研究，才能为甜菜遗传连锁图谱构建、重要性状基因标记定位与克隆、分子标记辅助选择育种提供良好的理论基础和科学依据。

试验表明，利用SRAP分子标记可以有效地进行甜菜品种的分子标记鉴定以及不同材料间的亲缘关系和遗传多样性分析。该法是2001年Quiros博士利用SRAP技术对芸薹属作物甘蓝进行DNA扩增，获得的片段有45%与GenBank数据库中的已知基因相同[17]。作为一种新型的DNA分子标记，SRAP标记的特点为多态性高，产率中等；重复性好；操作简单；在基因组中分布均匀；较易对扩增得到的目的片段进行测序；引物具有通用性，而且其正向引物可以与反向引物两两搭配组合，因此用少量的引物可以得到多个引物组合，提高了引物的使用效率，降低试验成本。

4 结论

利用SRAP分子标记能够简便有效地进行甜菜品种的分子标记鉴定以及不同材料间的亲缘关系和遗传多样性分析。按照UPGMA方法进行聚类分析，在遗传距离0.20处，可将东北地区的甜菜材料大致分为四大类群，分别为高产低糖低抗型的单胚品系和多胚二倍体品系；中产高糖高抗型的多胚四倍体品系和二倍体品系；高产高糖高抗型的多胚四倍体品系和二倍体品系；高产低糖抗丛根病型的品系和外国引进品种。聚类结果与生物学和经济学性状分类基本吻合，较好地显示了甜菜材料丰富的遗传多样性和遗传基础的差异性。结果表明，东北地区甜菜材料具有丰富的遗传多样性和遗传基础差异。中外材料的遗传基础存在明显的差异,只有4个甜菜品系和外国品种归为一类，可能是由外国品种杂交改良而成，遗传基础相近。本试验不足之处在于只进行了类群划分，反映了DNA水平上的遗传差异，但是不能确定材料之间究竟是哪些基因位点上的差异，以后应有目的地寻找丰产、高糖、抗性基因标记，为甜菜育种开辟新途径。

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