地龙提取物对神经母细胞SH-SY5Y细胞增殖的影响*

王玉 伍凤云 刘丹 林芬

（1江西省中医药研究院 南昌 330046；2南昌大学医学院2008级研究生 江西南昌 330006；3南昌大学医学院2009级研究生 江西南昌 330006）

地龙为环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓、通俗毛蚓、威廉环毛蚓或栉肓毛蚓的干燥体，其性咸寒，是我国重要且历史悠久的中药材之一，具有多方面的药理作用，如抑制血小板聚集[1]、降压[2]、平喘[3]等。本文对地龙提取物对体外神经细胞细胞增殖情况的影响进行研究，旨在寻找合适的体外药物浓度为临床给药剂量提供参考。现将结果报道如下：

1 实验材料

1.1 实验细胞 神经母细胞株SH-SY5Y：江西省中医药研究院中心实验室冻存。

1.2 试剂DMEM培养基 GIBCOBRL产品（批号：1024265，货号：12100-038）；小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司（批号：060209）；胰蛋白酶：Sigma产品（批号：4977，效价为 1:250）；MTT：Sigma产品（货号：M2128）。

1.3 主要仪器 超净工作台（SW-CJ-IF型，苏州净化设备厂）；二氧化碳培养箱（3164型，美国Forma scientic公司）；倒置显微镜（808434型，日本Nikon公司）；酶联免疫检测仪（KHB-ST360，上海科华公司）。

1.4 实验药物 地龙提取物：取地龙药材50g，10倍水量煎煮提取2次，1h/次，合并提取液，滤过，浓缩至100mL，加入乙醇配制成含乙醇终浓度为50%的药液，常温静置24h，取上清液浓缩至500mg/mL，用饱和NaOH调节pH至7.2～7.4，离心，上清液过0.45μm微孔滤膜除菌，滤液作为贮备液，置冰箱保存备用（所用药物浓度均以生药量计算）。

2 实验方法

2.1 神经母细胞SH-SY5Y传代培养 倒置显微镜下观察细胞生长情况，将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃掉，用无血清DMEM液洗一遍，加0.25%胰蛋白酶消化，当细胞变成圆形时小心弃去培养瓶中的液体，加适量DMEM完全培养液终止消化，弃去DMEM完全培养液，再加适量DMEM完全培养液并吹打细胞制成细胞悬液，置含5%CO2的二氧化碳培养箱内37℃培养。

2.2 MTT比色法 将培养对数生长期的神经母细胞株SH-SY5Y配成单个细胞悬液，调整悬液浓度并接种到96孔板中，5%CO2、37℃培养24h，分别给予实验各组含不同浓度地龙提取物的DMEM完全培养液，使药物终浓度分别为 2、5、10、20、30、40、50、80、100 mg/mL，对照组给予等体积的 DMEM完全培养液，每组 8 个复孔，5%CO2、37℃培养 48h，每孔加20μL 5mg/mL MTT，继续培养4h，终止培养，每孔加 150 μL DMSO，振荡10min，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测OD值。

3 实验结果

地龙提取物在2～10mg/mL浓度范围内，其OD值与正常对照组相比无统计学差异，P＞0.05，表明在此浓度范围内地龙提取物对神经母细胞株SH-SY5Y增殖无显著影响，且药物浓度在2mg/mL时对其生长有一定的保护作用。当浓度达到20mg/mL以上时，随着剂量增大OD值逐渐降低，与正常对照组比差别均有统计学意义，P＜0.01，并且抑制率也随着剂量的增大而增大，表明地龙提取物浓度达到20mg/mL以上时明显抑制神经母细胞株SH-SY5Y的增殖；并且当浓度达100mg/mL时，OD值为0，表明此时100%抑制。见表1。

表1 地龙提取物对神经细胞SH-SY5Y细胞增殖的影响 （±S）

表1 地龙提取物对神经细胞SH-SY5Y细胞增殖的影响 （±S）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01。

组别 n OD值 抑制率（%）正常对照组 8 0.5893±0.0481 -地龙提取物（2 mg/mL） 8 0.5980±0.0414 -1.48地龙提取物（5 mg/mL） 8 0.5490±0.0788 6.84地龙提取物（10 mg/mL） 8 0.5250±0.0538 10.91地龙提取物（20 mg/mL） 8 0.2551±0.0604* 56.71地龙提取物（30 mg/mL） 8 0.1966±0.0381* 66.64地龙提取物（40 mg/mL） 8 0.1429±0.0336* 75.75地龙提取物（50 mg/mL） 8 0.0818±0.0170* 86.12地龙提取物（80 mg/mL） 8 0.0180±0.0058* 96.94地龙提取物（100 mg/mL）8 0.0000±0.0000* 100.00

4 讨论

地龙为我国传统中药，具有较为广泛的药理学作用，中医临床用于治疗多种疾病。常规认为在常用剂量及传统给药剂量下本品无毒。但有研究发现蚯蚓应激分泌液的蛋白组分有剧毒性[4]。因此，应用地龙提取物时必须选择合适的剂量，既保证良好的临床效果，又降低对人体毒性。

MTT法是一种检测细胞存活和增殖的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，结晶的产量与活细胞数成正相关。MTT比色法因灵敏度高、操作简便、经济、快速而被广泛应用。

本文研究结果显示，地龙提取物在2～10mg/mL浓度范围内对神经母细胞株SH-SY5Y的存活无明显抑制作用，而且在2mg/mL时表现出保护作用，这意味着在临床上小剂量使用地龙提取物对神经系统具有康复保健、预防疾病发生的作用，这给地龙保健品的开发提供了实验依据。当浓度达到20mg/mL及以上时，细胞毒性呈跳跃式加强，随着剂量的增大神经细胞的抑制率也增大；当浓度达100mg/mL时，呈现100%抑制。提示：（1）地龙在小剂量使用时，对神经细胞体无毒性并且有一定的保护作用，这对预防脑中风的发病用药以及保健药品的开发具有指导意义；（2）地龙在大剂量使用时，不仅没有保护作用，而且对神经细胞有抑制生长的毒性作用，提示地龙在临床上的使用剂量不能过大，以免副作用的发生。

[1]韩正雪,赖光强,张维,等.地龙水煎剂对血小板聚集的影响[J].中外健康文摘·临床医药版,2008,5（4）：27

[2]冯敏超,康白,毛淑梅,等.地龙耐热蛋白对自发性高血压大鼠心肌血管紧张素Ⅱ水平及血管紧张素Ⅱ-1型受体表达的影响[J].现代中西医结合杂志,2007,16（26）：3 794-3 796

[3]张德新.五味地龙汤对哮喘豚鼠作用机制的试验研究[D].武汉：湖北中医学院,2007.78

[4]张租,何俐明,于培烂,等.蚯蚓毒素及其去除方法的初步研究[J].中国生化药物杂志,2001,22（3）：112-113