原生质体融合构建水稻病害生防多功能工程菌株

陈海荣，刘前刚，高书锋，魏小武，程 安，黄 军

（湖南省微生物研究所，湖南长沙410009）

随着科学技术的发展，生物农药以其高效、低毒、低残留、不易产生抗药性等优势，渐渐取代了传统化学农药的地位。原生质体融合技术，是指将一个细胞的遗传物质包括细胞核DNA和核外基因进入另一个细胞，有机的结合形成一个新的整体——融合子。如果融合子能稳定的存活下来，并具备双亲的特有性质，那么人们便能根据所需的特性，构建自己所需的工程菌株。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性枝状细菌。它最早是由日本人石渡于1901年从家蚕病尸虫体中分离出来，并在1915年由德国人Berliner命名的。其主要杀虫活性成分是内部一种或多种δ-内毒素[1]。现已证实苏云金杆菌可对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等9个目的500多种昆虫有不同程度的杀虫活性，对水稻常见害虫如二化螟、三化螟及纵卷叶螟均有杀治效果[2-4]。枯草芽孢杆菌SD是一类具有抗病性的细菌，能有效防治水稻稻曲病和纹枯病，为湖南省微生物研究所植保室筛选所得。笔者拟利用原生质体融合技术选育一株对水稻稻曲病和纹枯病有抑制效果，且能起到杀虫作用的工程菌株用于水稻的生物防治。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 供试菌株为苏云金芽孢杆菌Bt，枯草芽孢杆菌SD。

1.1.2 培养基 摇瓶培养基:蛋白胨2%，牛肉膏0.7%，葡萄糖0.3%，MgSO40.03%，KH2PO40.03%，pH 7.2～7.5，蒸馏水配置，121℃，0.8 kg/cm2蒸汽压力灭菌30 min。

固体培养基（平皿，斜面用）:配方同上摇瓶培养基，另加1.6%的琼脂粉，pH 7.2。

高渗固体培养基（原生质体再生，融合子再生用）:上述固体培养基加入0.5 mol/L的蔗糖，pH 7.2（底层）。

高渗固体培养基（上层）:同高渗固体培养基，琼脂含量为0.8%。

1.1.3 主要试剂与溶液 高渗缓冲液:顺丁烯二酸0.02 mol/L，MgCl20.02 mol/L，蔗糖 0.5 mol/L，pH 7.4左右，121℃，0.8 kg/cm2蒸汽压力灭菌30 min。

酶:溶菌酶，购自上海某生物公司，一定浓度的高渗缓冲液配制，先配成2 mg/mL的母液，使用时按需要的浓度用高渗液稀释，细菌过滤器过滤。

1.2 方法

（1）菌株筛选：从沙土管中取出保存的Bt菌株与SD菌株，分别转接入加有一定浓度的庆大霉素（Bt）和利福平（SD）的斜面培养基中，筛选出两种具有不同抗药性的菌株，培养待用。

（2）菌株活化：从斜面上挑取少量Bt和SD菌种，接种至摇瓶培养基中，30℃，220 r/min条件下培养14 h左右，进行活化。

（3）菌株培养：分别将活化14 h的两菌株发酵液1 mL移至 100 mL摇瓶培养基中，30℃，220 r/min培养一定时间。

（4）洗涤：取两种年轻菌液各4 mL到5 mL离心管中，离心3～5 min，除去上清，加入2 mL高渗缓冲液，振荡均匀，再离心，重复3次，洗去细胞表面的附着物，便于酶解。

（5）酶解去壁:加入一定量的酶，在一定温度的水浴锅中酶解破壁，得到原生质体。

（6）原生质体融合:将得到的Bt与SD原生质体等体积混合，8 000 r/min离心3 min，加入40%PEG 2 mL 和 Ca（NO3）2饱和液 0.2 mL，混匀，放入41℃水浴中融合30 min。

（7）原生质体再生培养:融化低层高渗固体培养基，冷却至45℃时，加入庆大霉素和利福平，浓度均为1μg/mL，摇匀，倒平皿，作为底层培养基，每平皿20～25 mL。融化上层高渗培养基，冷却至45℃时按1∶5的比例将融合的原生质体悬浊液与其混匀，倒入底层培养基中，每皿5 mL左右，凝固后，放入恒温箱30℃培养。

（8）待平皿中有菌落生成时，初步认定为融合子。

（9）传代培养:用相同浓度的庆大霉素和利福平制作双抗试管斜面若干，将平皿中的菌落挑取少量接入其中，传接10代，确保其菌体稳定。

（10）菌株鉴定：取出10代菌体，进行与双亲菌株性质的比较和鉴定。

2 结果与分析

2.1 生长曲线的测定及培养时间的选择

分别将活化14 h的两菌株发酵液1 mL移至100 mL空白摇瓶培养基中，摇匀，取15支无菌大试管，每支加入 5 mL，30℃，220 r/min 培养，每 1 h 取样一次，测定560 nm下的吸光度[5]。作图1，算出对数生长期，以便保证酶对细胞壁的作用效果最好。

在菌龄的选择上，多采用对数生长期或生长后期的菌，这是因为菌体的不同生理状态直接影响到细胞壁的结构，对数生长期细菌的细胞壁中肽聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感。由图1可知，培养5 h左右后，Bt与SD都进入对数生长期。为确定被酶解破壁的细胞为对数生长期细胞，我们把活化的菌体在摇瓶中培养的时间确定为5 h。

2.2 酶解浓度的选择

在 Bt和 SD菌液中分别加入 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL浓度的溶菌酶，酶解2 h，平板计数法观察原生质体的得率[6]，确定最佳酶解浓度。以酶浓度为横坐标，原生质体得率为纵坐标作图2。

图2 不同溶菌酶浓度对Bt和SD原生质体得率的影响

酶浓度过低，会影响原生质体得率，过高，则对后期试验有影响。由上图可知，两菌株的酶解破壁都很彻底，得率在80%以上。其中SD对酶更为敏感，得率也更高。可以初步确定，Bt的最佳酶解浓度为0.8 mg/mL，SD的最佳酶解浓度为0.6 mg/mL。

2.3 酶解时间的选择

选择好酶解浓度后，我们用最佳浓度对Bt和SD两菌液进行酶解，每10 min取样一次，平板计数法计算两菌株原生质体得率，用酶解时间为横坐标，原生质体得率为纵坐标作图3。

有研究表明[7-8]，不同微生物在原生质体制备过程中最适酶解时间差异很大。酶解时间不够，得到的原生质体数量过少，融合效果不好；酶解时间过长，原生质体得率提高，但破壁过于彻底对原生质体再生会产生不利影响。由图3可知，Bt在酶解70 min后，原生质体得率基本稳定，SD在酶解50 min后，原生质体得率基本稳定。可以基本确定，Bt的最佳酶解时间为70 min，SD的最佳酶解时间为40 min。

2.4 融合子的初步检测

将两原生质体等量加入到高渗缓冲液中融合后，在特定的双抗培养基中有菌斑出现。挑选菌株在双抗培养基中传接10代，确保其稳定性。随机挑选4个10代菌体接入含水稻稻曲病和纹枯病病原菌的培养皿中，作CK空白对照，观察结果如图4所示。由图4可知，在接种菌株后的培养皿中，菌斑周围有明显的透明环，说明该菌落对水稻稻曲病和纹枯病病原菌有抑制作用，具备亲本SD的抗菌效果。

选新鲜水稻叶片在一定浓度的融合子溶液中浸渍3 s，取出自然晾干，放入10个培养皿中。其中5个培养皿的叶片上接入10头水稻二化螟2龄幼虫，另外5个培养皿的叶片上接入10头水稻纵卷叶螟2龄幼虫，密封。48 h后观察幼虫死亡情况，发现近半害虫已经死亡。这说明该融合子有杀虫功效，具备Bt的性质。

3 小结

利用细胞融合技术构建新型多功能工程菌，为生物农药的研制和开发提供了新的方法和思路。本试验选取了两种不同功能的微生物菌种Bt与SD，通过融合实验条件的摸索，初步确定了菌种培养时间、酶解最佳浓度、酶解最佳时间，对融合子进行了部分的验证，基本符合预想的功效。准备结合形态学、生理生化特性及基因检测技术，对融合子进行进一步检查和证实。我们希望能筛选得到一株既能杀虫有能防治病害的融合子，为下一步开发微生物生防制剂打下坚实基础。

[1]黄 大，林 敏.农业微生物基因工程[M].北京:科学出版社，2001.

[2]韩新才，黄志农，蔡福民，等.苏云金杆菌和三唑磷混剂防治水稻二化螟田间药效[J].昆虫知识，2005，42（4）：450-452.

[3]徐 健，苏建坤，徐 熙，等.苏云金杆菌与杀虫单混用防治水稻螟虫[J].江苏农业科学，1999，（6）：42-43，51.

[4]吴洪生，许钟明，赵南海.苏云金杆菌BtS387菌株防治水稻纵卷叶螟试验[J].上海农业学报，2002，18（4）：90-91.

[5]钱存柔，黄仪秀.微生物学实验教程[M].北京：北京大学出版社，2008.

[6]罗立新.细胞融合技术与应用[M].北京：化学工业出版社，2004.

[7]Gokhale D.V，Deobagkar D.N.Differential Expression of Xylanases and Enddog-lucanases in the Hybrid Derived from Intergeneric Protoplast Fusion between a Cellulomonas sp.And Bacillus subtilis[J].Applied and Environmental Microbiology,1989，10:2675-2680.

[8]崔宗强，罗信昌.羊肚菌原生质体制备与再生[J].菌物系统，2003，22（3）：498-501.