经皮冷冻猪肺的影像学和病理学研究

牛立志 王静 邱大卫 周亮 吴炳辉 方刚

唐俊 穆峰 李海波 梅保君 邓春梅 邓春娟 郝卓芳 徐克成

肺癌已成为最常见死因的恶性肿瘤之一，大部分确诊时已属中晚期，失去了手术切除机会[1-4]。对不能手术切除的肺癌，冷冻是一种安全可选择的消融治疗手段。研究[5-7]显示冷冻治疗肝癌、肾癌、胰腺癌等实体器官肿瘤时，一般认为应将冷冻范围超过肿瘤边缘，即所谓“1 cm安全边缘”，以达到全部消融靶组织的目的。但与冷冻肝脏、胰腺等实体器官不同，肺为含气组织，气体阻碍热量的传导，冷冻范围在理论上很难超过肿瘤边缘，从而难以获得完全消融。为了解决肺冷冻的技术问题，本研究观察了猪肺经皮冷冻的影像学、大体解剖学和组织学表现，试图在不同冷冻条件下探讨经皮冷冻肺的治疗技术方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6只月龄均为12个月的西藏小型猪由南方医科大学动物实验中心提供。平均体重为23 kg，均有健康合格证书。常规喂养，实验前2周内接受常规检查，无饮食和行为异常。分别将6只猪标记为猪1、2、3、4、5和6。本研究设计获得复大医院伦理委员会的批准。

1.2 冷冻治疗系统 冷冻设备采用氩氦冷冻系统（EndorcareTM, CA, USA），该系统是根据焦耳定律设计，其原理是高压气体经过狭窄的喷嘴进入探针尖端，压力突然下降，不同的气体在局部产生不同的温度变化。氩气引起温度降低（可达-150oC），氦气可使温度升高（可达60oC）。

1.3 实验方法 对猪进行捆绑固定，将猪右侧卧位，对术区进行消毒、备皮等。用速眠新3 mL诱导麻醉，然后给予1.5%-2%浓度异氟醚维持全身麻醉，氧流量保持在1.5 L/min。在CT下，选择猪左肺上叶1点和下叶2点作为靶点，将1.7 mm冷冻探针分别插入左肺上叶和下叶各靶点。以100%的氩气激活探针，使针尖温度达（-140±5）oC，持续10 min，改输氦气复温至（25±5）oC，持续5 min，为第1个循环。重复上述冷冻/复温循环，共行2个循环。左肺冷冻完成后，将猪左侧卧位，对猪的右肺冷冻与左肺冷冻时相似，同样选择3个靶点进行冷冻，不同点是做了3个循环的冷冻-复温循环：即先行2个冷冻5 min、复温5 min的循环，第3循环为冷冻10 min、复温5 min。术中对猪进行心肺监护。冷冻完毕后拔针，用明胶海绵止血。术后肌注速尿20 mg、地塞米松5 mg和青霉素160 IU。6只猪的实验条件和实验方法均相同。

1.4 术后观察 猪1在术后表现为体温降低，心跳减慢，于3 h40 min后死亡。其余猪麻醉苏醒后正常圈养，第1天即给予正常饮食，观察其生命体征和器官功能。喂养期间未给予静脉输液、抗生素或其它药物。

1.5 标本的选取 猪1死亡后立即解剖，猪2和3在术后3天、猪4、5和6在术后7天分别静脉给予戊巴比妥注射液100 mg/kg处死（此处置方法获得复大医院伦理委员会批准）。解剖取大体肺组织标本。将凡是黑色区域的冷冻部位假定为靶组织，称为“假定坏死区”。测量假定坏死区最大径数值，然后取中心区、边缘区及边缘外1 cm处的组织（图1），福尔马林溶液固定、苏木精-伊红溶液染色后，在光镜下观察组织学变化。使用20倍的放大率， 每个部位观察6个样本。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，实验数值均使用Mean±SD描述，用配对样本t检验对计量资料进行分析， 以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺冷冻的CT下表现 CT下，冷冻区（冰球）表现为相对于肺的高密度实变影，冷冻探针表现为金属高密度影。最初形成的实变影相对模糊，与外周界限不清晰。随着冷冻时间的延长，实变影逐渐清晰，显示冰球逐渐增大。图2显示猪3冷冻过程中CT显示的冰球演变，其大小随冷冻时间延长，冰球最大径增加由最初的2.4 cm→3.2 cm→2.9 cm→3.2 cm→3.5 cm→3.3 cm，呈现随着冷冻时间延长冰球逐渐增大的趋势。一般在复温后冰球范围较大，而再次冷冻后冰球变小，提示复温后渗出，引起冰球增大。

左肺行冷冻2个循环，冷冻总时间为20 min；右肺行冷冻3个循环，总冷冻时间也为20 min。右肺3个循环形成的冰球大于左肺2个循环形成的冰球（表1）。图3显示猪2不同冷冻-复温循环的左肺和右肺CT影像学变化。

2.2 肺冷冻的大体表现 猪1为冷冻后急性死亡，冷冻部位有出血，猪2、3和猪4、5、6分别在冷冻术后第3天和7天死亡，胸腔内有少量渗液和出血。6只猪肺的假定坏死区均呈黑色，与周围形成明显界限（图4）。假定坏死区最大径猪1超过其它猪；6只猪右肺3个冷冻-复温循环的假定坏死区范围均超过左肺2个循环（表1）。

测定6只猪肺CT下冰球、假定坏死区最大径，结果如表1。从表1可见，CT影像下右肺的冰球大于左肺，右肺3个循环冷冻假定坏死区范围大于左肺2个循环，差异具有统计学意义（P＜0.05）。6只猪双肺冰球大小为（2.5±0.4）cm，假定坏死区大小为（3.4±0.7）cm，无论猪为急性死亡或术后3天、7天处死，双肺假定坏死区均较冰球大，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图 1 肺冷冻区标本选取示意图Fig 1 Specimens selected draft of the freezing area of the lung

图 2 冷冻过程中（3个循环）冰球的CT表现Fig 2 Sequential changes of the pulmonary parenchyma on computed tomographic scanning after freezing and thawing(3 cycles). A: 5 min after the beginning of first freezing; B: 5 min after the beginning of first thrawing; C: 5 min after the beginning of second freezing; D: 5 min after the beginning of second thrawing; E: 10 min after the beginning of third freezing; F: 5 min after the beginning of third thawing.

2.3 肺冷冻的组织学改变 6只猪肺的冷冻中心区在组织学上均呈现完全性坏死；在中心区周围的假定坏死区内，猪1有活存细胞存在，而其它猪肺呈现全部出血性坏死；在假定坏死区边缘外1 cm处， 6只猪肺均无明显坏死（图5）。此结果显示猪1的组织学坏死区小于假定坏死区，而冷冻3天后，其它猪肺假定坏死区和组织学坏死区大小一致。各猪左、右肺病变无明显差别。此外，急性死亡的猪1标本出血、水肿病变较其余两组严重，术后7天处死的猪4、5和6标本肉芽组织增生较其余两组明显。

3 讨论

冷冻疗法已愈来愈多用于实质器官如肝、肾和前列腺肿瘤的治疗。冷冻区内温度与距离冷冻探针的远近有关。中心部温度可能降至-160oC—-196oC，但在可见到的冰球外缘温度常为0oC。业已证明，冷冻温度为0oC—-30oC时，细胞无明显损伤；冷冻温度为-40oC—-50oC 时，细胞死亡率明显增加。一般认为-40oC是引起靶细胞死亡的临界温度[5,8]。在此温度以下的区域为有效冷冻区。为了达到这一目的，临床上沿用外科手术切除肿瘤的“1 cm安全边缘”概念[9]，即扩大冷冻范围，将有效冷冻范围扩展至肿瘤外至少1 cm[6]。

图 3 猪2不同冷冻-复温循环对CT上冰球大小的影响Fig 3 Pig 2's ice-ball change under different freeze-thaw cycles. Above is left lung after 2 freeze-thaw cycles cryo, diameter was 1:2.1 cm (A), 2:2.1 cm (B), 3:2.4 cm (C), respectively;Below is right lung after 3 freeze-thaw cycles cryo, diameter was 4:2.6 cm (D), 5:2.7 cm (E), 6:2.6 cm (F), respectively.

表 1 6只猪右肺与左肺的冰球和假定坏死区大小（cm）Tab 1 Compare hypothetical necrotic area with the ice-ball in both lungs (cm)

图 4 冷冻术后不同时间内双肺冷冻区的大体表现Fig 4 The morphological description of both lungs'sample at different times after cryoablation

图 5 猪肺冷冻区光镜下的组织学改变 (HE, ×20)Fig 5 Pathology of cryolesion of each pig under microscope (HE, ×20). A: lung tissues hemorrhage, necrosis; B: lung tissues hemorrhage, necrosis; C: lung tissues hemorrhage, necrosis; D: lung tissues vasodilatation, congest, lung tissues edema hemorrhage; E: alveolar septum congest edema, lung tissues hemorrhagic necrosis; F: necrosis around granulation tissue,alveolar epithelium and bronchiolar epithelium hyperplasia; G: alveolar structure is still maintained, part alveolar septum capillaries congests, few hemorrhage; H: alveolar structure is normal, part alveolar septum capillaries congests; I: alveolar structure is normal, surrounding alveolar capillaries congests，RBC and hemosiderin macrophages in part of alveolus.

如同肝、肾的肿瘤冷冻一样，在理论上对肺癌的冷冻也应覆盖肿瘤周围10 mm宽的正常肺组织。但与肝、肾等实质器官不同，肺内含有气体，会阻碍低温传导，以致不能形成足够大的冰球，难以获得肿瘤周围“1 cm安全边缘”。为了克服这一障碍，有人主张增加冷冻-复温循环数。第1个循环冷冻复温后，肺泡内出血，将气体驱除，因此再次冷冻可使冰球扩大[10]。Izumi等[11]的实验显示，应用3 mm冷冻探针做第1个循环肺冷冻所形成的冷冻区为（3.3±1.4）cm2，而第2个循环后即增加至（10.6±3.4）cm2（P＜0.05）。Kawamura等[12]主张做3个循环冷冻-复温。他们发现用2 mm或3 mm冷冻探针冷冻可形成直径2.5 cm-3 cm冷冻区，而做3个循环冷冻-复温后冷冻区可扩展至4 cm。

我们应用正常猪模型在CT引导下做经皮肺冷冻实验，发现冰球大小随着冷冻-复温循环次数增加而增大，但我们也发现了文献中从未提及的一些现象：①肺冷冻，不管是2个循环抑或3个循环冷冻-复温，所产生的冷冻范围（假定坏死区）在大体标本上，均超过CT上冷冻过程中显示的冰球大小；②冷冻后近期，冷冻区边缘部有活存细胞，但3天后则边缘区均已坏死；冷冻后随着时间延长，组织学坏死区逐步增大，3天及以后，假定坏死区在组织学上全部呈现坏死，两者大小无明显区别，换句话说，假定坏死区就是组织学坏死区。

为何肺大体上冷冻区全部获得组织学坏死，而且范围超过CT上显示的冰球大小，尚难有合理解释，可能与肺泡组织对冷冻特别敏感、易于发生坏死或凋亡有关，但也可能由于冷冻后肺泡组织的血液供应受到严重破坏，进而引起次级或延迟性靶组织坏死，冷冻后随着时间延长坏死区扩大的事实可以此解释。

本研究说明，经皮冷冻肺可以达到有效破坏靶组织的目的。在技术上，以3个冷冻-复温循环为佳；冷冻范围不一定太大，不强求冷冻“1 cm安全边缘”，以免伤及肿瘤附近器官和组织，这在冷冻治疗临近心脏和大血管的肺肿瘤时尤为重要。此外，冷冻后7天，冷冻区可见胶原生成，肺泡上皮和支气管上皮的增生较明显，这也是冷冻区别于射频的优点，冷冻区可以保存组织支架，有利于恢复。

如果以上发现能进一步在临床上得到证实，则在肺癌冷冻治疗时，可能不一定需要把冷冻范围扩展到肿瘤外的“1 cm安全边缘”，肺冷冻范围不一定太大，只要稍微超过肿瘤本身范围即可，特别在CT上如果冰球超过肿瘤即足够，因为冷冻后范围会扩大，这对于减少正常组织破坏、简化治疗过程和减少并发症具有临床价值。我们应用经皮冷冻治疗中央型肺癌的经验显示，某些病人的肿瘤紧靠心脏或大血管，冷冻时无法获得“1 cm安全边缘”，但术后局部无复发，患者长期生存[13]，提示对肺癌的冷冻在技术上可能与冷冻其它实质性肿瘤不同。