5-氯苯并三唑对重组人蛋白激酶CK2全酶活性的影响*

5-氯苯并三唑对重组人蛋白激酶CK2全酶活性的影响*

李春梅1，2)，林小聪2)，刘新光2)#，陈小文2，3)，梁念慈2)
1)广东药学院生物化学与分子生物学教研室广州510006 2)广东医学院生物化学与分子生物学研究所湛江524023 3)深圳市儿童医院儿科研究所深圳518026
#通讯作者，男，1964年10月生，博士，教授，研究方向：生物化学，E-mail：xgliu64@126.com

蛋白激酶CK2;重组蛋白;全酶;5-氯苯并三唑;酶动力学

目的：观察5-氯苯并三唑对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制。方法：在体外等物质的量混合CK2 α’和β亚基构成重组CK2全酶。以重组人CK2全酶为分子靶点，通过测定转移到CK2底物上的γ-32P ATP的32P放射活度来检测不同浓度5-氯苯并三唑对CK2活性的影响，并进行动力学分析。结果：0、1、3、9、27、81及243 μmol/L的5-氯苯并三唑对重组人CK2全酶均具有抑制作用，且该作用随浓度的增加而增强(F= 165.552，P＜0.001)，IC50为20.10 μmol/L;它与ATP呈竞争性抑制CK2的活性，抑制常数Ki为18.63 μmol/L;与酪蛋白呈非竞争性抑制CK2的活性，抑制常数Ki为22.58 μmol/L。结论：5-氯苯并三唑是重组人蛋白激酶CK2的抑制剂。

1 材料与方法

1.1 材料 5-氯苯并三唑购自美国Aldrich公司;肝素、精胺及ATP购自美国Sigma公司;P81磷酸纤维素滤纸购自英国Whatman公司;γ-32P ATP购自北京福瑞生物工程公司;其余试剂为国产分析纯产品。重组人CK2α’和β亚基的原核表达、纯化与鉴定参见文献［8-10］，将纯化的重组人CK2α’与β亚基等物质的量混合构成重组人CK2全酶。

1.2 5-氯苯并三唑对重组人CK2全酶活性的影响

将5-氯苯并三唑稀释到0、1、3、9、27、81及243 μmol/L，每反应管加入受试药物10 μL，再加入反应混合液15 μL［含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)，150 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，50 μmol/L ATP，γ-32P ATP 1.85×104Bq(比活1.85×1017Bq/mol)，去磷酸化酪蛋白2 g/L］，最后加入重组CK2全酶10 μL，室温反应10 min后取30 μL点至直径2 cm的P81磷酸纤维素滤纸上终止反应，阴干，用85 mmol/ L磷酸洗涤数次，最后用丙酮洗涤1次，80℃烤干后加闪烁液，液闪仪计数。每min催化1 pmol γ-32P ATP上的32P转移到酪蛋白上所需的酶量为1个酶活性单位(cpm)。根据半数效量概率单位法［11］计算IC50：以浓度的对数为横坐标，以相应浓度抑制率的概率单位为纵坐标，做图并求出直线回归方程，根据方程计算IC50值(50%抑制时的概率单位为5)。

1.3 5-氯苯并三唑对重组人CK2全酶影响的动力学分析 根据IC50结果，选择3种不同药物浓度(0，10，40 μmol/L)进行实验分组。在固定酪蛋白浓度为2 g/L、ATP浓度为10～80 μmol/L情况下，测定CK2的活性(相当于反应速度);或在固定ATP浓度为10 μmol/L、酪蛋白浓度(1～8 g/L)条件下，测定CK2活性。各分别进行3次独立实验，每次实验每个样品同时做3个平行管。采用Lineweaver-Burk做图法，以1/S和1/V做图显示酶的动力学结果(S表示底物浓度，V表示反应速度)，求出酶动力学参数表观米氏常数Km和表观最大反应速度Vmax，以此判断5-氯苯并三唑对CK2抑制作用的类型;根据上述动力学参数计算得出抑制常数K［12］。

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1.4 统计学处理 应用SPSS 11.0进行统计分析，对不同浓度5-氯苯并三唑作用后重组人全酶活性的影响比较用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 5-氯苯并三唑对重组人CK2全酶活性的抑制作用 实验结果表明，5-氯苯并三唑对重组人CK2全酶有较强的抑制作用，该作用随药物浓度的增加而增强(表1)。根据效量概率单位法求出的直线回归方程为：Y=1.117 4X+3.543 2(R2=0.997 9)，其IC50为20.10 μmol/L。

表1 5-氯苯并三唑对重组人蛋白激酶CK2全酶活性的影响(n=3)

2.2 酶动力学分析结果

2.2.1 不同浓度ATP条件下5-氯苯并三唑对CK2作用的动力学分析 动力学结果见图1，表2。

图1 不同浓度ATP条件下

表2 不同浓度ATP条件下5-氯苯并三唑对CK 2作用的动力学分析结果

可以看出，随着药物浓度的增加，Km增大，而Vmax基本不变，双倒数作图的交点位于纵坐标上，因此5-氯苯并三唑与ATP呈竞争性抑制重组人CK2全酶活性。抑制常数Ki为18.63 μmol/L。

2.2.2 不同浓度酪蛋白条件下5-氯苯并三唑对CK2作用的动力学分析 动力学结果见图2，表3。

图2 不同浓度酪蛋白条件下

表3 不同酪蛋白浓度条件下5-氯苯并三唑对CK 2作用的动力学分析结果

双倒数作图的交点位于横坐标上，因此5-氯苯并三唑与酪蛋白对重组人CK2活性的作用属于非竞争性抑制，抑制常数Ki为22.58 μmol/L。

3 讨论

作者观察了卤代苯并三唑衍生物中的一种——5-氯苯并三唑对重组人蛋白激酶CK2全酶的作用，并进行酶动力学分析。结果表明，5-氯苯并三唑能明显抑制蛋白激酶CK2全酶的活性，IC50为20.10 μmol/L;而且它与ATP呈竞争性抑制 CK2活性(Ki=18.63 μmol/L)，与酪蛋白呈非竞争性抑制CK2活性(Ki=22.58 μmol/L)。5-氯苯并三唑对CK2的抑制活性和亲和作用小于传统的CK2抑制剂——5，6-二氯 1-β-D-呋喃核糖苯并咪唑［12］(DRB，其化学结构见图3A，IC50为13 μmol/L，Ki为23 μmol/L)和4，5，6，7-四溴苯并三唑［6］(TBB，其化学结构见图3B，IC50为0.9μmol/L，Ki＜1 μmol/L)。这可能是由它的结构特点决定的：三唑环取代了咪唑环，可能增加了其抑制活性;但是卤素含量减少，可能又降低了其抑制活性。

图3 2个有效的CK 2抑制剂的化学结构图

［1］Wang G，Ahmad KA，Unger G，et al.CK2 signaling in androgen-dependent and-independent prostate cancer［J］.J Cell Biochem，2006，99(2)：382

［2］Hamacher R，Saur D，Fritsch R，et al.Casein kinaseⅡinhibition induces apoptosis in pancreatic cancer cells［J］.Oncol Rep，2007，18(3)：695

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［4］Tawfic S，Yu S，Wang H，et al.Protein kinase CK2 signal in neoplasia［J］.Histol Histopathol，2001，16(2)：573

［5］李春梅，刘新光，梁念慈.蛋白激酶CK2与HIV的生命周期［J］.国外医学：临床生物化学与检验学分册，2002，23(4)：208

［6］Sarno S，Moro S，Meggio F，et al.Toward the rational design of protein kinase casein kinase-2 inhibitors［J］.Pharmacol Ther，2002，93(2/3)：159

［7］Garcia-Echeverria C，Traxler P，Evans DB.ATP site-directed competitive and irreversible inhibitors of protein kinases［J］.Med Res Rev，2000，20(1)：28

［8］陈小文，刘新光，梁景耀，等.人蛋白激酶CK2α’亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化与性质鉴定［J］.中国生物化学与分子生物学报，2004，20 (2)：176

［9］刘新光，梁念慈，马涧泉，等.重组人蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与测序［J］.中国生物化学与分子生物学报，1999，15(2)：228

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［11］杨树勤.中国医学百科全书——医学统计学［M］.上海：上海科学技术出版社，1985：197

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(2009-03-30收稿 责任编辑王 曼)

Effect of 5-chlorobenzotriazole on recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme

LI Chunmei1，2)，LIN Xiaocong2)，LIU Xinguang2)，CHEN Xiaowen2，3)，LIANG Nianci2)

1)Department of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Pharmaceutical College，Guangzhou 510006 2)Institute of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023 3)Paediatrics Institute，Shenzhen Children’s Hospital，Shenzhen 518026

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的第二信使非依赖性蛋白激酶，在肿瘤的生长中发挥重要作用［1-4］。此外，其在HIV-1复制、转录及裂解细胞等功能的调控中起重要作用，一些CK2抑制剂具有抗HIV-1活性［5］。因此认为CK2在抗肿瘤及抗病毒药物研究方面是一个具有吸引力的分子靶点，其特异性抑制剂具有潜在的临床应用价值［6］。目前已知的CK2抑制剂多为ATP-结合位点的竞争性抑制剂，主要包括异喹啉衍生物、卤代苯并咪唑/苯并三唑衍生物及天然的蒽醌衍生物［7］。CK2在组织细胞中含量极低，从组织中直接提取纯化比较困难。为筛选CK2抑制剂，作者以重组CK2α’亚基与β亚基等物质的量混合构成的全酶［8-10］作为研究

*广东省自然科学基金资助项目 05011579;广东省医学科研基金资助项目 B2007093

protein kinase CK2;recombinant protein;holoenzyme;5-chlorobenzotriazole;enzyme kinetics

Aim：To observe the direct effect of 5-chlorobenzotriazole on recombinant protein CK2 holoenzyme and its kinetics.Methods：The CK2 α’and β subunits were mixed at the same molar ratio and reconstituted CK2 holoenzyme.The recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme was used as a molecular target.The CK2 activity and its kinetic analysis were assayed by detecting incorporation of32P of［γ-32P］ATP into the substrate in the various conditions.Results：5-chlorobenzotriazole at 0，1，3，9，27，81 and 243 μmol/L inhibited the holoenzyme activity of recombinant human protein kinase CK2，and the effect strengthened with the increase of the concentration(F=165.552，P＜0.001).IC50=20.10 μmol/L.Kinetic studies of 5-chlorobenzotriazole on CK2 showed that the inhibition was competitive with ATP with the Kiof 18.63 μmol/L and noncompetitive with casein with the Kiof 22.58 μmol/L.Conclusion：5-chlorobenzotriazole is an effective inhibitor of CK2 holoenzyme.材料，观察5-氯苯并三唑(卤代苯并三唑类衍生物类抑制剂)对纯化的重组人CK2全酶活性的影响，报道如下。

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