降解纤维素菌株的筛选和鉴定

季祥，蔡禄

（内蒙古科技大学生物工程与生物技术研究所，内蒙古 包头 014010）

降解纤维素菌株的筛选和鉴定

季祥，蔡禄

（内蒙古科技大学生物工程与生物技术研究所，内蒙古 包头 014010）

从腐木、腐根、腐叶、腐草、土样、牛胃等样品中筛选获得11株降解纤维素的菌株，对其进行羧甲基纤维素钠平板培养基水解圈的测量，以及羧甲基纤维素钠酶活力的测定，获得1株活性相对较高的菌株，定名为CJ-3，并对其进行了分类学鉴定初步确定为单胞菌属，并对其进行了保存。

纤维素酶；菌株筛选；鉴定

农作物秸秆作为一种可再生资源，在我国具有分布广、数量大、种类多、价格低廉的特点。如何充分利用这些资源而又使环境不受污染，是现代农业面临的难题[1]。农作物秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素三大组分组成，由于纤维素特别是木质素难以被分解，影响其利用推广。近几十年来，国内外科研人员虽然研究了一些物理、化学的秸秆利用方法，但都存在着利用不充分、成本高等问题[2]。实践表明，秸秆的生物法利用是最佳途径，此法具有降解率高，安全环保，成本低等优点。

纤维素酶在充分利用农作物秸秆等农副产品废弃物，降解秸秆中的纤维素，开发新能源方面具有巨大的应用潜力[3]，目前，用于纤维素酶生产的菌株多为木霉、青霉及曲霉等[4]，但其产生的酶普遍存在活力较低的问题。筛选高效纤维素分解菌，确定纤维素酶的固态发酵工艺，是利用秸秆纤维素的关键。本试验从多种土样中，选出高活性纤维素分解菌株，并对其进行了初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

城郊农村采集不同地点土样，杂草地土样，发霉的腐芦荟叶，内蒙古科技大学院内腐烂的树皮、树根，屠宰场取牛胃内物，等样品共20份。

1.2 培养基

1.2.1 富集培养基 K2HPO42 g，（NH4）2SO41.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.3g，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnSO41.7 mg,CoCl22 mg，新华1号滤纸2 g，pH5.5，121℃灭菌30 min。

1.2.2 分离筛选培养基 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）15 g，NH4NO31g，酵母膏1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41 g，H2O1000 mL，琼脂2%，pH自然，121℃灭菌30 min。

1.2.3 液体产酶鉴定培养基 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）15g，NH4NO31g,MgSO4·7H2O 0.05g，KH2PO41g，H2O1000mL，pH自然，121℃灭菌30min。

1.3 菌株的分离、纯化

1.3.1 富集培养过程 向各样品瓶中注入50 mL无菌水，玻璃珠充分振荡，灭菌纱布过滤，静置，取上清液1 mL接种于250 mL装有增殖培养基50 mL的三角瓶中。摇床210 r/min、28℃培养72 h。之后再将培养液转入无菌的新鲜增殖培养基中，反复培养3次，使菌富集。

1.3.2 菌株的分离筛选 移取富集培养液0.1 mL于CMC-Na培养基上作平板涂布，菌体在28℃琼脂平板生长3 d后，每个平板倒入20 mL刚果红溶液（1 mg/mL）染色2 h后，加入适量1 mol/L氯化纳溶液洗涤，测量菌体和透明圈直径。

1.3.3 CMC液体摇瓶筛选 选取透明圈、菌落直径比值较大菌落及滤纸生长的菌株进行产酶发酵试验。将菌体接种于CMC-Na产酶鉴定培养基，28℃、170 r/min摇床培养5 d后测定羧甲基纤维素钠酶（CMCase）活力。

1.4 酶活力测定

1.4.1 酶液制备 取培养5 d的发酵液10 mL，在4℃、4 000 r/min条件下离心15 min后，取上清液即为粗酶液。

1.4.2 CMCase酶活力的测定 取0.5 mL适当稀释酶液，加pH值4.8的醋酸钠缓冲液，配制1%羧甲基纤维素钠1.5 mL，于50℃酶解0.5 h，加入2 mL的DNS显色液于沸水浴5 min，冷却后在540 nm下测吸光值。

2 结果与讨论

2.1 刚果红平板筛选

20株菌株在羧甲基纤维素钠刚果红琼脂平板上有11株菌株能够生长，表1为纤维素降解菌透明圈反映菌株基本生长情况。

表1 纤维素降解菌透明圈

从表1看出CJ-3和KD-2生长情况较好，透明水解圈较大。

2.2 酶活测定

11株菌株通过CMC-Na培养基培养后的酶活力测定见表2

表2 纤维素降解菌CMCase酶活力的测定

从表2可以看出菌株的变化较大，ZC-1、NW-1和CJ-3的CMCase酶活力相对高一些。

2.3 菌株鉴定

我们对CJ-3菌株进行了初步的鉴定，通过形态学观察CJ-3菌株为长杆状、产芽孢、有鞭毛、能运动；菌落表面光滑、不透明，边缘不整齐呈丝状；革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阳性，V.P反应阳性，能发酵葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇产酸，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，水解酪素及淀粉，不能利用丙酸盐，明显产生过氧化氢酶，不能分解卵磷脂，没有卵磷脂酶活性，在含7%的NaCl培养基中能生长。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[5]初步鉴定该菌株为纤维单胞菌属（Cellulomonas）。

3 结论

本实验从当地取20份样品，经过初筛、划线培养得到11株可降解纤维的菌株，我们对11株菌株进行了水解圈的测定比较得出CJ-3和KD-2的生长情况较好，CMCase酶活力的测定ZC-1、NW-1和CJ-3的CMCase酶活力相对酶活较高，通过分析确定对CJ-3菌株进行了初步的鉴定，根据菌落形态，菌株的显微观察和生理生化特征初步鉴定该菌株为单胞菌属（Cellulomonas）。

本实验得到的部分菌株已经进行了保存，以便将来的继续筛选，诱变作用，复合菌的联合作用以及基因工程等进一步研究。

［1］ 黄忠乾，龙章富，彭卫红，等.农作物秸秆资源的综合利用[J].资源开发与市场，1999，15（1）：32-34.

［2］ 张木明，徐振林，张兴秀，等.预处理对稻草秸秆纤维素酶解产糖及纤维素木质素含量的影响[J].农产品加工·学刊，2006，58（3）：4-6.

［3］ 陈子爱，邓小晨.微生物处理利用秸秆的研究进展[J].中国沼气，2006，24（3）：31-35.

［4］ 刘颖，林亲录.纤维素酶制取与应用研究进展[J].中国食物与营养，2006，4：33235.

［5］ 布坎南RE，吉本斯NE.伯杰氏细菌鉴定手册[M].第八版，北京：科学出版社，1984.

book=2010,ebook=61

10.3969/j.issn.1008-1267.2010.01.013

Q93-331

A

1008－1267（2010）01-0034－02

2009-07-21

教育部春晖计划（Z2007-1-01020）、内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJzy08233）、包头市科技攻关项目（2008y1002-2）

季祥（1978-），男，硕士，讲师，从事生物质能、生物制浆研究。蔡禄（1964-），男，博士，教授，从事生物质能、生物信息、分子生物学研究。