芪棱汤对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障通透性及基质金属白酶－3表达的影响＊

周荣峰

芪棱汤对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障通透性及基质金属白酶－3表达的影响＊

周荣峰

目的观察芪棱汤对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障通透性及基质金属蛋白酶－3(MMP－3)表达的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、模型组、芪棱汤去养阴药组(对照组)及芪棱汤组(治疗组)。采用颈内动脉线栓法复制大鼠脑缺血再灌注(MCAO/Reperfusion)模型。通过测定渗出血管外的伊蓝(EB)含量来评价血脑屏障通透性的变化，在再灌注不同时点采用免疫组织化学法检测MMP－3的表达。结果在再灌注各时间点，治疗组、对照组与模型组比较均有显著差异，治疗组、对照组EB渗出量、MMP－3表达少于模型组;治疗组与对照组有显著差异，治疗组EB渗出量、MMP－3表达少于对照组。结论芪棱汤对脑缺血再灌注后的保护作用，其机制可能与通过抑制MMP－3表达保护血脑屏障有关。

脑缺血再灌注损伤 芪棱汤 血脑屏障 基质金属蛋白酶－3

广东省深圳市宝安区石岩人民医院(深圳518108)

＊广东省深圳市科技计划非资助项目(No.200903189)

缺血再灌注损伤是一个复杂的、多因素参与的过程，血脑屏障的完整性在脑缺血再灌注损伤的病理生理过程中起着重要的作用。缺血后再灌注将导致血脑屏障严重破坏，从而促发明显的脑水肿和梗死。大量研究证实，蛋白酶是导致缺血再灌注损伤的主要因子。本实验通过观察芪棱汤对脑局灶性缺血再灌注后血脑屏障通透性的变化和基质属蛋白酶－3(MMP－3)表达的影响，进一步阐明芪棱汤抗脑缺血再灌注损伤机制。

1 材料与方法

1.1 材料 动物:SD雄性大鼠126只，SPF级，体质量(300±30)g，月龄4个月左右。由广东省医学实验动物中心提供，合格证号:2007A010。试药:芪棱汤精制液(黄芪、桑椹、天花粉、三棱、莪术、枳壳、豨莶草、水蛭)，芪棱汤去养阴药精制液，均由深圳市人民医院制剂中心提供;伊蓝(EB)、MMP一3兔多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 分组 126只SD大鼠随机分为芪棱汤组(治疗组)、芪棱汤去养阴药组(对照组)、模型组，每组40只，假手术组6只，前3 组每组又分为缺血 3h 再灌注 6、12h、1、3、7d 5 个亚组，各亚组每组8只。

1.3 给药 各组在实验前7d灌胃相应药物，治疗组灌服芪棱精制液，对照组给予芪棱汤去养阴药精制液，每次20mL/kg，其余两组予等剂量生理盐水。每12小时给药1次，每日2次，直至处死。采用盲法给药，给药由专人负责，造模者回避。

1.4 造模方法 造模方法采用在Zea longa[1]基础上改良的颈内动脉线栓加环扎法。

1.5 血脑屏障通透性评价 各组大鼠均在处死前30min通过尾静脉注射2%EB 2mL/kg，用甲酰胺浸泡法[2]测量脑组织中的EB含量。建立EB标准曲线，求出各标准管相应的光密度值(X)与EB含量(Y)的直线回归方程:Y=11.33 X－0.347。取缺血灶周围约0.4g脑组织标本，称取质量后放人盛有4mL甲酰胺的试管中，加上橡皮塞，45℃水浴24h，加温数小时后用一根细棒将浮在上面的脑组织轻轻加压后使其下沉，使脑组织中EB能充分溶解出来。水浴24h后用吸管轻轻吸出上清液，然后比色测光密度值。脑组织EB含量(μg/g)=A×甲酰胺量(mL)/脑湿质量(g)，A为根据标准曲线回归方程求得的样本EB含量，单位为μg/mL。

1.6 免疫组织化学方法检测MMP－3表达 各组在再灌注的各时间点取动物，断头处死，以视交叉为中线取约4mm厚的脑组织，平分切成2mm厚的脑片，置于4%多聚甲醛中固定。常规石蜡包埋，切片，片厚4μm。。切片收集于0.01mol/L PBS液内，用多克隆兔抗MMP－3抗体，采用漂浮法对其进行免疫组织化学染色。MMP－3阳性表达为细胞质染色，阳性染色为棕黄色，正常细胞呈绿色。

2 结果

2.1 各组脑组织EB渗出量 见表1。假手术组可见极少量EB渗出。模型组在再灌注6h脑组织EB渗出量增加，可见损伤区蓝染较正常区域颜色深，再灌12h脑组织EB渗出量逐渐增加，再灌注1d脑组织EB渗出量达到高峰，再灌注3d以后逐渐减小。对照组、治疗组与模型组表达规律一致。在再灌注6、12h、1、3、7d，治疗组、对照组与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)，治疗组、对照组EB渗出量少于模型组(P ＜0.01);治疗组EB渗出量少于对照组(P ＜0.01)。

表1 各组再灌注各时间点脑组织EB含量变化 (μg/g，±s)

与模型组比较，＊P ＜0.01;与对照组比较，△P ＜0.01。下同

组别假手术组模型组对照组治疗组6h 0.20 ± 1.04 1.62 ± 1.04 0.92 ±2.63＊0.38 ±0.99＊△12h－2.15 ±0.57 1.31 ±1.31＊0.81 ±1.38＊△1d－3.13 ±1.53 2.32±1.76＊1.46 ± 0.08＊△3d－2.56 ±1.81 1.73 ±2.01＊0.83 ±1.17＊△7d－1.65 ±0.57 0.91 ±1.33＊0.26 ±1.82＊△

2.2 各组MMP－3表达的动态变化 见表2。MMP－3在小胶质细胞、缺血神经元、内皮细胞、中性粒细胞中表达，免疫阳性细胞呈现淡棕黄色。假手术组可见微弱MMP－3表达。模型组再灌注6h即有表达，1d明显增多，3d达到高峰，以后逐渐下降。对照组、治疗组与模型组表达规律一致。再灌注 6、12h、1、3、7d，治疗组、对照组与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)，治疗组、对照组MMP－3表达少于模型组 (P＜0.01);治疗组MMP－3表达少于对照组(P ＜0.01)。

3 讨论

缺血性脑梗死属于中医学“中风”的范畴，历代医家对中风有不同的看法，提出了许多不同的治疗方法。自清代王清任提出“气虚血瘀”理论，将补气药及活血化瘀并用，创补阳还五汤后，中医学对缺血性脑梗死的治疗多从“气虚血瘀”角度出发采用益气活血法。而对“津血同源”、“阴虚致瘀”的理论认识运用不足。本课题在“津血同源”、“阴虚致瘀”等理论的基础上，给合多年临床经验提出了“气阴两虚、瘀血阻络”是缺血性脑梗死的又一重要病机，并在此基础上根据“增水行舟”的理论[3]，创立益气养阴活血方剂芪棱汤。本方重用黄芪大补脾胃之元气，令气旺血行，瘀去络通，为君药;桑葚、天花粉滋阴生津，增液以行舟，令气行血运为臣药;三棱、莪术、枳壳、豨莶草活血祛瘀，水蛭通经活络，均为佐药。本方配伍特点为大量补气药与滋阴药相配，并佐以少量活血药，共起补气养阴活血之功。芪棱汤用于临床治疗脑梗死等缺血性脑血管病，取得令人满意的疗效[4－6]。

神经细胞、胶质细胞、微血管内皮细胞间的相互依存关系是组成和维持脑功能及结构的必要条件，血脑屏障参与血脑物质交换的调节，而神经元的直接生存微环境是神经元和胶质细胞间的细胞间液，即细胞外基质(ECM)[7]。脑组织中ECM是维持血脑屏障结构完整性的重要组成部分，其中基底膜尤为重要。它由ECM分子如Ⅳ型胶原、层黏蛋白和纤维连接蛋白构成，为血管的完整性提供结构支持[8]。MMPs是一组含锌酶的基因家族，能降解基底膜成分，导致血脑屏障的破坏，参与到神经系统炎症的反应中。MMP－3的底物包括胶原(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅹ型)、纤维连接蛋白、层黏连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖等几乎全部的ECM成分，是一种重要的调节ECM的蛋白酶。Falo等[9]报道MMP－3可以通过重构细胞外基质，促进突触重建，调节脑损伤修复。

本研究发现，在再灌注 6、12h、1、3、7d，治疗组、对照组与模型组比较差异均有统计学意义，治疗组、对照组MMP－3表达、EB渗出量明显少于模型组;治疗组MMP－3表达、EB渗出量明显少于对照组。提示芪棱汤可能通过抑制MMP－3的活化介导的血脑屏障的破坏，进而减轻脑缺血再灌注损伤，且芪棱汤优于芪棱汤去养阴药汤，即益气养阴活血法优于益气活血法。

表2 各组再灌注各时间点MMP－3阳性细胞计数(个/视野，±s)

表2 各组再灌注各时间点MMP－3阳性细胞计数(个/视野，±s)

组别假手术组模型组对照组治疗组6h 1.13 ±0.76 8.82 ± 1.42 5.21 ±1.03＊2.08 ±0.44＊△12h－12.15 ± 0.97 8.33 ±0.74＊5.21±1.01＊△1d－19.21 ± 1.38 14.35 ± 1.76＊11.03±0.68＊△3d－21.56 ± 0.81 17.03 ± 1.17＊13.41±1.07＊△7d－15.33 ± 1.07 10.16 ±1.33＊5.73 ±0.82＊△

[1]Zea Longa E，Weinsten P R， Carlom S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat.[J]Stroke，1989， 20(1):84－91.

[2]虞佩兰，杨于嘉.小儿脑水肿与颅内高压[M].北京:人民卫生出版社，1999:350.

[3]蒋红玉，曹平.“增水行舟法”治疗血栓病初探[J].中医药学报，2003，31(6):13 －14.

[4]蒋红玉，张思为，陈欣童，等.芪棱汤治疗脑梗死34例疗效观察[J]. 新中医，2002，34(12):35 －35.

[5]蒋红玉，邓世芳，曹平.芪棱汤合针刺治疗脑梗死疗效观察[J].中国中医急症，2004，13(3):130 －132.

[6]蒋红玉，郭少军，山林林.芪棱汤对短暂性脑缺血发作患者血液流变学的影响[J].中国临床康复，2004，34(12):7735－7736.

[7]关新民.医学神经生物学 [M].北京:人民卫生出版社，2002:55－60.

[8]Manuel Y，Mafia S，Elizabeth G，et al.Tissue － type plasminogen activator induces opening of the blood－brain barrier via the LDL receptor related protein[J].J CIin Invest，2003，112:1533 － 1540.

[9]Falo M C，Fillmore H L，Reeves T M，et al.Matrix metalloproteinase －3 expression profile differentiates adaptive and maladaptive synaptic plasticity induced by traumatic brain injury[J].J Neurosci Res，2006，84(4):768 － 781.

Effect of Qileng Decoction on the Blood-brain Barrier Permeability and the MMP-3 Expression in Rats with Cerebral Ischemia Reperfusion

ZHOU Rong-feng
Shiyan People’s Hospital， Baoan District， Shenzhen City， Guangdong Province(Shenzhen 518108)

Objective:To study the effect of Qileng Decoction on the blood-brain barrier permeability and the MMP-3 expression in rats with cerebral ischemia reperfusion.MethodsRats were randomly divided into the sham-operation group， the model group， the control group and the treatment group.The control group was given Qileng Decoction without nourishing yin herb.The treatment group was used Qileng Decoction.The MCAO model was established by the method of internal carotid artery occlusion by suture.The variation of the blood-brain barrier permeability was detected by the EB content exudation vascular.The MMP-3 expressions in different time points were detected by the immunohistochemistry method.ResultsIn different reperfusion time points， there were some significant differences in the treatment group， the control group and the model group.The EB exudation content and the MMP-3 expression of the treatment group and the control group were lower obviously than those of the model group.There was a remarkable difference between the treatment group and the control group.The EB exudation content and the MMP-3 expression of the treatment group were lower significantly than those of the control group.ConclusionThe mechanism of that Qileng Decoction could protect the function after cerebral ischemia reperfusion could be related to its inhibition the MMP-3 expression to protect the blood-brain barrier.

Cerebral ischemia reperfusion injury;Qileng Decoction;Blood-brain barrier;MMP-3

R285.5

A

1004－745X(2010)09－1554－03

2010－03－08)