清热化瘀滋阴方对系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞凋亡及临床指标的影响*

梁 卫 张丽玲 龚 林 金 琳 蔡 鹰 黄重发 唐永明

解放军第454医院（南京 210002）

清热化瘀滋阴方对系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞凋亡及临床指标的影响*

梁 卫 张丽玲 龚 林 金 琳 蔡 鹰 黄重发 唐永明

目的观察中药清热化瘀滋阴方对系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血淋巴细胞凋亡及临床指标的影响。方法 选取SLE患者80例，随机分为治疗组（清热化瘀滋阴方联合激素）与对照组（单用激素）各40例，服药3个月比较两组患者外周血淋巴细胞凋亡情况及临床指标变化。结果两组治疗后外周血淋巴细胞凋亡率均较治疗前明显下降，治疗组明显低于对照组;治疗组血常规、血沉、免疫球蛋白（IgG）、补体C3、抗核抗体（ANA）、抗ds-DNA抗体均较治疗前明显改善，且白细胞、血小板、C3、IgG、ANA指标的恢复优于对照组。结论清热化瘀滋阴方治疗活动期SLE有明显优势，临床指标明显改善，其可能通过降低外周血淋巴细胞凋亡率，改善免疫紊乱而发挥作用。

系统性红斑狼疮 清热化瘀滋阴方

解放军第454医院（南京 210002）

*南京军区“十一五”攻关课题面上项目（No.06MA73）

系统性红斑狼疮（SLE）是一种多因素参与的多脏器多系统损害并伴有多种免疫学异常的自身免疫性疾病。目前多采用激素、免疫抑制剂治疗该病,但不良反应较多。我们近年针对SLE活动期以血热瘀毒、肾虚阴亏证为多见，采用清热化瘀滋阴方配合激素治疗SLE患者40例，临床各项指标好转。研究发现SLE发病与淋巴细胞凋亡密切相关[1]，笔者运用流式细胞仪检测SLE患者服药前后外周血淋巴细胞凋亡率的变化，探讨清热化瘀滋阴方治疗SLE的作用机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2006年12月～2008年12月解放军第454医院、江苏省中医院门诊及住院SLE患者80例，随机分为治疗组与对照组各40例。治疗组男性6例,女性34例;年龄18～60岁,平均30.5岁;病程2个月至5年,平均2.0年。对照组40例,男性5例,女性35例;年龄18～58岁,平均29.9岁;病程3个月至6年，平均2.3年。两组资料差异无统计学意义（P＞0.05）,具有可比性。

1.2 病例选择 西医诊断按照1992年美国风湿病协会制定的SLE诊断标准[2];中医辨证参照《中药新药临床研究指导原则》[3]属“热毒、血瘀、阴虚”证。排除妊娠期、哺乳期妇女，合并有心、肝、肾、肺、脑、造血系统有严重损伤或严重感染者，以及其他自身免疫性疾病者。

1.3 治疗方法 对照组予强的松30mg/d，顿服。治疗组在此基础上另予清热化瘀滋阴方：水牛角片12g（先煎），生地黄 12g，麦冬 12g，丹皮 10g，赤芍 10g，金银花18g，连翘12g，白花蛇舌草20g，青风藤15g，秦艽10g，紫草10g，炒白术10g。每日1剂，加水300mL浸泡30min，水牛角片先煎30min，再加入其它药同煎，武火煮沸后改文火煎20min，浓缩约100mL，每日2次温服。两组均以3个月为1个疗程，治疗1个疗程。

1.4 检测指标 （1）SLE患者外周血淋巴细胞凋亡的检测。试剂与仪器：淋巴细胞分离液、Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒均购于深圳晶美生物工程有限公司;流式细胞仪为美国B＆G公司生产。SLE患者外周血淋巴细胞的分离：分别抽取患者服药前及服药3个月后清晨空腹肘静脉血2mL,置100g/L EDTA抗凝的无RNA酶试管中,用0.9%氯化钠溶液对倍稀释，缓慢加入2mL淋巴细胞分离液之上,2000r/min离心20min,取淋巴细胞层,加0.9%氯化钠溶液稀释洗涤,1500r/min离心15min,弃上清，再加0.9%氯化钠溶液1mL稀释混匀,移入1.5mL Eppendorf管，1500r/min离心10min，弃上清。流式细胞仪检测SLE患者外周血淋巴细胞凋亡率：制备外周血淋巴细胞，去离子水按1∶4稀释结合缓冲液，用预冷PBS洗细胞2次，用250μL结合缓冲液重悬细胞，浓度为1×106/mL，取100μL细胞悬液于5mL流式管中，加5μL Annexin VFITC和10μL 20μg/mL碘化丙锭溶液，混匀后于室温避光孵育15min，加400μL PBS，流式细胞仪分析结果。（2）临床检测指标：血常规采用五分类血细胞分析仪 （美国Beckman-coulter公司生产）;血沉采用E＆H-64型仪器及ESR试剂盒检测 （Steellex Instrument公司生产）;IgG、补体C3、ANA、抗ds-DNA抗体采用美国Beckman-Coulter公司生产的仪器及IgG、补体C3、ANA、抗ds-DNA抗体试剂盒检测。

1.5 统计学处理 应用SPSS 12.0统计软件。计量资料以（±s）表示,采用 t检验。

2 结果

2.1 两组治疗前后外周血淋巴细胞凋亡率比较 见表1。结果表明，活动期SLE患者外周血淋巴细胞凋亡率明显升高，治疗组治疗后淋巴细胞凋亡率较治疗前明显下降（P＜0.01），与对照组比较差异有统计学意义（P ＜0.01）。

2.2 两组治疗前后临床指标比较 见表2，表3。结果表明，治疗组治疗后较治疗前ESR、IgG、ANA、抗ds-DNA抗体明显下降（P＜0.05或 0.01），补体C3及WBC、RBC、PLT明显升高，与治疗前比较差异有统计学意义 （P＜0.01）。对照组治疗后ANA明显下降（P ＜ 0.01），补体 C3、WBC、RBC、PLT 显著升高（P ＜0.05或0.01）。两组治疗后比较，治疗组改善明显优于对照组（P＜0.05或0.01）。

表1 两组治疗前后外周血淋巴细胞凋亡率比较（%，±s）

表1 两组治疗前后外周血淋巴细胞凋亡率比较（%，±s）

与本组治疗前比较，*P＜0.05，**P＜0.01;与对照组治疗后比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同

n组别治疗组对照组40 40治疗前11.97±3.08 13.11±2.58治疗后2.26±0.62**△△6.35±1.46**

表2 两组治疗后血常规变化情况比较 （±s）

表2 两组治疗后血常规变化情况比较 （±s）

组别治疗组（n=40）对照组（n=40）治疗前治疗后治疗前治疗后WBC（×109/L）3.05±0.33 4.52±0.98**△△3.10±0.37 3.41±0.85*RBC（×1012/L）3.47±0.28 4.12±0.38**3.48±0.93 3.91±0.67*PLT（×109/L）85.26±27.31 145.16±30.12**△△86.18±28.05 119.51±32.76**

表3 两组治疗后免疫学指标变化情况比较 （±s）

表3 两组治疗后免疫学指标变化情况比较 （±s）

组别抗ds-DNA抗体治疗组（n=40）对照组（n=40）治疗前治疗后治疗前治疗后ESR（mm/h）57.80±28.31 45.35±21.63*60.78±35.65 53.17±9.61补体C3（g/L）0.50±0.18 0.95±0.26**△△0.46±0.09 0.79±0.15**IgG（g/L）22.58±4.22 18.37±3.69**△20.86±3.36 19.24±5.28 ANA（%）1∶（163.24±13.67）1∶（73.72±13.16）**△△1∶（145.31±13.50）1∶（83.18±13.55）**80.15±25.32 63.08±19.56**75.82±23.52 70.95±20.15

3 讨论

SLE是一种全身性多器官自身免疫病,可侵犯身体多个器官，目前尚无特效疗法。中医学将其归属于“阴阳毒”、“日晒疮”、“痹证”等范畴，多认为由于先天禀赋不足、肝肾阴亏,加之七情内伤、劳倦过度、饮食内伤、六淫侵袭、日光曝晒,致使邪毒乘虚而入,热毒灼炽,耗伤津液,血脉瘀阻，初起侵袭肌表血脉筋骨，进而内侵脏腑。本病初期的主要病机为热炽、血瘀、阴亏。根据这一特点，我们拟用清热化瘀滋阴方清热凉血、解毒散瘀以治其标，养阴扶正以顾护阴液而治其本。方中以水牛角、白花蛇舌草泻火解毒、凉血止血为主，配金银花、连翘清热解毒并透邪热，取“入营犹可透热转气”之意;生地黄以清热凉血、养阴生津，与麦冬共同顾护阴液;赤芍、丹皮凉血散瘀;紫草凉血活血、解毒化斑;青风藤活血通络止痛;生白术健脾化湿，顾护中焦脾胃。诸药合用,补虚泻实，正邪兼顾，泻不伤正,凉血止血又活血散瘀。药理研究证实水牛角片能缩短DIC大鼠凝血酶原时间、凝血酶时间，升高血小板数[4];白花蛇舌草可抗炎、调节免疫活性，其富含的熊果酸和齐墩果酸有增强免疫作用[5];赤芍总苷能降低血瘀大鼠血液黏度、纤维蛋白原含量和红细胞聚集指数，减少红细胞压积，改善血液流变学指标[6]。临床观察表明，清热化瘀滋阴方有明显升高WBC、RBC、PLT、补体C3及降低ESR、IgG、ANA、抗ds-DNA抗体的作用。

近年研究认为SLE患者外周血淋巴细胞凋亡加速，并与SLE的疾病活动程度呈正相关[1]。正常生理情况下，细胞凋亡时凋亡小体可迅速被吞噬细胞或邻近细胞吞噬。当细胞凋亡率加快，凋亡小体不能被及时清除，其内含的核小体释放入血，刺激机体产生抗DNA等多种自身抗体[7]。核小体作为自身抗原也可刺激机体产生核小体抗体，两者结合形成免疫复合物，沉积于肾小球基底膜、血管内膜等各组织器官，造成严重的免疫病理损伤[8]。另一方面，正常情况下发挥调理素功能的补体与巨噬细胞表面相应补体受体结合，促使巨噬细胞吞噬、清除凋亡细胞。但SLE患者淋巴细胞的凋亡率升高，血清补体C3水平明显下降，发挥调理素功能的补体减少，同时巨噬细胞表面相应补体受体缺陷[9]，导致巨噬细胞吞噬凋亡细胞的功能下降。因此SLE发病与淋巴细胞凋亡增多及凋亡细胞清除障碍密切相关。本研究观察了清热化瘀滋阴方对SLE患者外周血淋巴细胞凋亡率的影响，结果发现，该方配合激素能明显降低SLE患者外周血淋巴细胞凋亡率，并显著优于单用激素，说明清热化瘀滋阴方可能通过降低患者外周血淋巴细胞凋亡率，清除增多的凋亡细胞、凋亡小体及循环免疫复合物，调节免疫紊乱而发挥治疗作用。至于该方对淋巴细胞凋亡相关基因Fas/FasL、Bcl-2等基因表达的影响，有待进一步研究。

[1]Mevorach D.Systemic lupus erythematosus and apoptosis:a question of balance[J].Clin Rev Allergy Immunol,2003,25（1）:49～60.

[2]Wallace DJ,Haha BH.Dubois's Lupus erythematosus[M].5th ed.Baltimore：Wialliams and wilkins,1997：627～633.

[3]中华人民共和国卫生部.中药新药临床研究指导原则（第1辑）[S].1993:221.

[4]金若敏，陈长勋，范广平，等.犀角与水牛角药理作用的研究[J].中成药,1997,19（7）:33.

[5]Kim Sung Hoon,Ann Byung Zun,Ryu Shi Yong.Antitumour effects of ursolic acid isolated from Oldenlandia diffusa[J].Phytothe-rapy Research,1998,12（8）:553～556.

[6]徐红梅，刘青云，戴敏，等.赤芍总苷协调抗血栓作用研究[J]. 安徽中医学院学报，2000，19（1）：46 ～47.

[7]张兴民，蒋明，郑德先.细胞凋亡与系统性红斑狼疮[J].国外医学·免疫学分册，1998，21（3）:148～151.

[8]Koutouzov S,Jeronimo AL,Campos H,et al.Nucleosomes in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus[J].Rheum Dis Clin North Am,2004,30（3）：529 ～ 558.

[9]Gaipl US,Voll RE,Sheriff A,et al.Impaired clearance of dying cells in systemic lupus erythematosus[J].Autoimmun Rev,2005,4（4）:189～194.

Effect of Qingrehuayuziyin Decoction on Lymphocyte Apoptosis and Other Clinical Indices of the Patients with Systemic Lupus Erythematosus

LIANG Wei,ZHANG Li-ling,Gong lin,et al
454 Military Hospital of China（Nanjing 210002）

Objective:To investigate the effect of Qingrehuayuziyin Decoction on lymphocyte apoptosis and other clinical indices of the patients with systemic lupus erythematosus（SLE）.Methods:80 SLE patients were selected and divided randomly into two groups.40 patients in the treatment group were given the Qingrehuayuziyin Decoction combined with the hormone.40 patients in the control group were just given the hormone.After 3 months,the lymphocyte apoptosis and the clinical indices were compared between two groups.Results:The rates of lymphocyte apoptosis decreased significantly in two groups.Meanwhile,the rate in the treatment group was lower obviously than that of the control group.Compared with the control group,there were some indices improving significantly in the treatment group including:the blood routine examination,the blood sedimentation,the IgG,the complement C3,the anti-nuclear antibody （ANA）and the double stain DNA antibody.In the treatment group,the recoveries of the leukocyte,platelet,C3,IgG and ANA were also superior to those of the control group.Conclusion:Qingrehuayuziyin Decoction has obvious advantage in SLE of active stage.From this method,the clinical indices improve obviously.This is related to the suppressing lymphocyte apoptosis and the modifying the immune status.

Systemic lupus erythematosus;Qingrehuayuziyin Decoction

R593.24

B

1004-745X（2010）01-0041-03

2009-07-02）