银杏叶提取物对衰老小鼠脑组织 Klotho蛋白表达的影响及机制

邓 刚, 彭 海, 杨艳飞, 于凤芹

衰老和抗衰老是 21世纪生命科学研究的热点。目前,衰老的确切机制还不十分清楚,新的抗衰老基因 Klotho(KL)的发现,为研究衰老及衰老相关疾病提供了新的思路[1]。KL基因主要在脑脉络丛、海马及肾脏表达,分泌型 KL蛋白已被认为是一种抗衰老调节激素。KL蛋白与肾脏疾病、骨病及糖代谢等的关系,已有较多研究报道,但迄今为止,还鲜见在体研究小鼠脑脉络丛 KL蛋白表达的变化及机制。作者既往的研究和覃红斌的研究显示银杏叶提取物(ginkgo biloba extrat,GBE)具有防治脑血管病及抗衰老的作用,主要机制与抑制氧化应激有关[2,3]。但目前尚未见GBE对小鼠脑脉络丛KL蛋白表达的影响及其机制的报道。为此,作者进行相关研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和药物 D-半乳糖(美国 Sigma),银杏叶提取物(贵州益佰制药股份有限公司)。MDA及 SOD检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。Klotho单克隆抗体(美国 Santa Cruz)。RIPA蛋白提取液内参、β-actin鼠源抗体、辣根酶标记羊抗鼠二抗、SABC试剂盒(武汉博士德公司)。蛋白质 Marker(美国 Amresco)。

1.2 实验动物和分组 健康清洁级雄性昆明小鼠 48只,3月龄,体重 35±3g,购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。小鼠随机分为对照组、D-gal模型组、GBE组和 D-gal联合 GBE组,每组 12只。

1.3 按照余资江等的方法 予 D-gal 120mg/kg/d颈部皮下注射,建立衰老小鼠模型[4]。对照组:给予等体积生理盐水皮下注射和等体积 1%羧甲基纤维素(Carboxymethyl cellulose,CMC)溶液灌胃。GBE组:将 GBE粉剂与 1%CMC溶液配制成浓度为 2.5%的 GBE混悬液,50mg/kg/d灌胃。D-gal联合 GBE组:按 D-gal组和 GBE组方法。每组给药均持续 6w。然后 10%水合氯醛(500mg/kg)深度麻醉,断头取大脑用 4%多聚甲醛固定,用于免疫组织化学检查。

1.4 免疫组织化学检测 第三脑室周围脑组织石蜡切片常规脱蜡至水,3%H2O2孵育,正常山羊血清封闭,顺序滴加一抗 KL单克隆抗体(滴度 1∶50)、羊抗鼠二抗、链酶亲和素-生物素-酶复合物(SABC)液,DAB显色剂。复染,脱水,透明,封片后显微镜观察。分析单位视野下,阳性区域的光密度(Integrated optical density,IOD)。

1.5 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的检测 取小鼠海马组织,用预冷 0.9%氯化钠溶液 10倍稀释后,充分匀浆,4000r/min离心 5min,吸取上清液按试剂盒说明书测 SOD活力和 MDA含量。

1.6 Western Blot检测脑脉络丛 KL蛋白 提取小鼠脑脉络丛总蛋白,用 Braford方法测定蛋白含量。10%SDS-PAGE凝胶电泳 1.5h分离蛋白。转到 PVDF膜,置含 5%脱脂奶粉的 PBS中室温封闭2h,加入一抗(KL 1∶300)4℃过夜,加入二抗室温2h,PBST洗涤 3次后,DAB显色,凝胶成像仪用白光成像后,用美国 Quantity One 4.4.0软件分析,所得光密度强度(OD)等数据以直方图的形式给出并计算出 KL蛋白 OD值与 β-actin蛋白 OD值的比值。

2 结 果

2.1 一般情况观察 正常对照组和 GBE组小鼠毛发光亮而浓密、活泼好动、皮肤富有弹性。与对照组小鼠相比,D-gal模型组小鼠 4w后逐渐出现衰老表现:毛发稀疏、毛色发暗、少动、行动迟缓、饮食量逐渐减少、皮肤松弛、弹性下降等。D-gal联合GBE组小鼠出现不同程度的毛发稀疏、少动、皮肤松弛、弹性下降、行动迟缓等衰老症状,这些症状在同一个体不完全出现且程度较 D-gal模型组轻。

2.2 免疫组化染色结果 KL蛋白阳性表达为棕褐色颗粒。与正常对照组相比,D-gal模型组 KL蛋白表达明显降低(P＜0.01),GBE组 KL蛋白表达明显增高(P＜0.01)。与 D-gal模型组相比,GBE组和 D-gal联合 GBE组 KL蛋白表达明显增高(P＜0.01)。

2.3 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的测定 与正常对照组相比,D-gal模型组海马MDA含量升高(P＜0.01),SOD含量降低(P＜0.01)。与 D-gal模型组相比,GBE组和 D-gal联合GBE组 MDA含量均降低(P＜0.01),SOD含量均增高(P＜0.01)(见表1)。

2.4 Western Blot检测结果 与正常对照组(Con)相比,D-gal模型组 KL蛋白表达明显降低(P＜0.01)。与 D-gal模型组相比,GBE组和 D-gal联合 GBE组 (D+G)KL蛋白表达明显增高(P＜0.01),而且以 GBE组更明显。

表1 各组小鼠海马组织氧化水平变化 ±s)

表1 各组小鼠海马组织氧化水平变化 ±s)

与正常对照组比*P＜0.01;与D-gal组比▲P＜0.01

组别 鼠数(只) MDA(nmol/mg protein)SOD(U/mg protein)正常对照组D-gal模型组GBE组D-gal+GBE组66662.23±0.282.94±0.31*2.03±0.24▲2.36±0.25▲115.89±8.8991.43±6.76*126.12±9.63▲105.10±7.43▲

3 讨 论

关于衰老的分子机制,目前主要有自由基学说、线粒体学说和端粒学说,但都不能完全解释整个衰老过程。Kuro等[1]最先发现的与衰老相关的新基因-KL基因,为研究衰老带来了新的突破。KL基因突变导致小鼠出现类似于人类衰老的各种表型如动脉粥样硬化、血管内皮受损等。当用外源正常 KL基因补充后,小鼠衰老表现明显缓解。

KL基因在人和小鼠中均定位于第 13号染色体(13q12),基因全长 50kb,包含 5个外显子和 4个内含子。KL基因通过选择性剪接产生膜型和分泌型两种蛋白,人类以分泌型 KL蛋白为主,含有 549个氨基酸,小鼠含有 550个氨基酸。KL蛋白具有类似于 β-葡萄糖苷酶的催化活性,主要在脑脉络丛、海马、肾等组织中表达[5],血清中也可检测到 KL蛋白,并且随着年龄的增长表达下降,提示 KL蛋白是一种与人的年龄和衰老密切相关的体液因子[6]。本研究也显示 D-gal致衰老模型小鼠脉络丛 KL表达水平较正常对照组明显降低。目前,分泌型 KL蛋白已被认为是一种抗衰老调节激素,对多种靶器官发挥生理效应[7]。

衰老的自由基学说认为,各种因素最后都通过干扰机体的氧化与抗氧化系统的平衡,使自由基的累积增多,清除率下降而影响衰老过程[8]。国内对D-半乳糖的多年研究显示,其引起的代谢紊乱是拟老化反应的重要因素。给动物连续注射 D-半乳糖后,因其代谢产物半乳糖醇不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内,影响正常渗透压,导致细胞肿胀,抗氧化防御系统毁损,自由基积聚,而出现与自然衰老相似的自由基代谢紊乱特征[9]。本研究显示 D-gal导致小鼠脑组织的 SOD活性显著降低,MDA含量显著升高,KL蛋白表达明显下降,提示 D-gal导致小鼠衰老的同时使自由基产生增多,抗氧化能力减弱,并与 KL蛋白表达有一定的关系。

GBE的有效成分黄酮类化合物和萜内酯是非常重要的两类生物活性物质,其药理作用已受到广泛的关注。GBE具有抗氧化活性,可减缓内皮干细胞衰老以及抑制红细胞衰老[10～12]。本研究显示,与D-gal模型组比较,给予 GBE的小鼠,衰老表现不明显,并且小鼠脑组织的 SOD活性显著提高,MDA含量明显降低,KL蛋白表达明显上调。说明预防性给予 GBE可以增强抗氧化酶活性,减少氧自由基对脑组织的损伤,降低 MDA含量和氧化能力,同时能影响 KL的表达。因而认为 GBE具有延缓衰老的作用,并且可能是通过改善机体抗氧化能力,进而上调KL蛋白的表达来实现的。Yamamoto等发现,KL蛋白通过抑制 INS/IGF-1信号导致 Akt的去磷酸化,后者又抑制 FOXO1、FOXO3a、FOXO4等转录因子的磷酸化,这些转录因子在核内结合到各种抗氧化酶如 SOD、CAT的启动子上,从而增加它们的表达,清除氧自由基,增加对氧化应激的抵抗力[13,14]。Rakugi等研究也表明 KL具有调节氧化应激的功能[15]。因此,我们认为 GBE也可通过上调 KL蛋白表达,然后引起上述通路的变化,改善机体抗氧化能力,起延缓衰老的作用。

总之,本研究表明 D-gal可下调小鼠脑脉络丛KL蛋白的表达。GBE可提高小鼠的抗氧化活性及上调 KL蛋白表达,发挥延缓衰老的作用。本研究为 GBE成为防治衰老的植物源性药物提供了实验依据。

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