缺血后海马高迁移率族蛋白与星形胶质纤维酸蛋白表达及相关性

殷益宏, 任明山, 黄大可, 胡向阳

HMGB1又称晚期炎症因子,HMGB1从细胞核迁移至细胞浆的过程需要脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子 α(TNF-α)刺激,而其分泌到细胞外的过程则需要细胞外溶血磷脂酰胆碱的刺激,后者又需要磷脂酰胆碱在可溶性磷脂酶 A2(sPLA2)催化下合成,由于 sPLA2在炎症反应中合成较晚,这是 HMGB1出现迟于其他细胞因子的原因[1]。HMGB1是一种在真核细胞中表达,具有高度保守和非组蛋白性的核蛋白,胞外 HMGB1作为一种重要的晚期炎症介质,与炎症反应及其维持有关。脑缺血后,星形胶质细胞受到打击,过度激活增殖,并分泌 TNF-α[2]、HMGB1[3]等炎症因子;HMGB1可促进星形胶质细胞激活[4]。本实验观察大鼠在体缺血再灌注情况下,星形胶质细胞反应与 HMGB1时程变化关系。

1 材料和方法

1.1 实验材料 体重 250～300g普通级成年雄性 SD大鼠 60只(安徽医科大学实验动物中心提供)。一抗试剂盒,小鼠抗人 GFAP单克隆抗体,多克隆兔抗 HMGB1抗体,均购自北京博奥森生物技术有限公司;免疫组织化学(免疫组化)二抗试剂盒SP9000、生物素标记山羊抗兔小鼠 IgG、免疫荧光二抗试剂盒即用型号为 ZF-0313罗丹明标记山羊抗小鼠 IgG、ZF-0311 FITC标记山羊抗兔 IgG,均购于中山金桥生物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组 按随机数字表分为缺血组(n=30)及假手术组(n=30),两组再按处死时间点分为 1d、3d、7d、14d、28d 5个亚组,每个亚组 6只大鼠。

1.2.2 动物模型的制备 参照 Longa[5]线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞再灌注(MCAO/R)模型。动物饲养及手术室温度控制在 25℃左右,术前12h禁食不禁水。将大鼠以 300mg/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,仰卧固定于手术台上,取颈正中切口,分离暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,用双极电凝器电凝颈外的甲状腺上动脉分支,在距离颈总动脉分叉较远处,双线套扎颈外动脉,将远心端结扎,近心端打松结。在颈外动脉的残端壁上剪一约 0.2mm的小口,将带球面的栓线从此小口插入颈内动脉颅内端,栓线从颈总动脉分叉处插进,深度约为 18.5±0.5mm,遇有轻微阻力即停止,此时栓线圆球即堵塞大脑中动脉的开口。将栓线尾部固定在皮肤上,在伤口处滴入 0.5ml的庆大霉素,缝合颈部缺口,并将动物保温,待清醒后再放入笼内,2h后将线栓拔出约 10mm,恢复再灌注;假手术组除不进线外,手术制模过程同缺血组。按照 Longa的 5分法进行神经病学评分:0分,无神经缺损症状,活动正常;1分,左前肢不能完全伸直;2分,侧推抵抗力减弱,向左旋转;3分,向左侧倾倒;4分,不能自发行走,意识丧失。其中,0分和 4分者被剔除,随机补充,保持每组 6只不变。

1.2.3 免疫组化材料的准备 两组大鼠在术后各相应的时间点,以 10%水合氯醛按 300mg/kg体重腹腔注射麻醉后,开胸进左心室至深主动脉插管,依次用生理盐水,4%的多聚甲醛各 200ml经心脏灌注固定后断头完整地取脑,再置于 4%的甲醛溶液后固定 24h,蒸馏水浸泡 12h。常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。经视交叉后方开始连续冠状位切片,层厚 4μm,贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上,4℃保存备用。

1.3 指标检测

1.3.1 HE染色 光学显微镜下观察海马 CA1区病理变化。

1.3.2 免疫组化 石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精水化至水,微波修复 2次,在此步骤后严格按试剂盒说明操作,DAB显色时,显微镜下控制反应时间(5～10min)。此外,用 PBS取代一抗作空白对照。采用 Nikon 80i高清晰彩色病理图像分析系统对免疫组织化学切片进行图像分析,各切片在海马CA1区随机计数 5个高倍视野(400×),再测定GFAP、HMGB1吸光度,取此平均值作为测定值,吸光度越高,蛋白表达越多。

1.3.3 免疫荧光双标 石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精水化至水,微波修复 2次,非免疫性动物血清封闭液(1∶10)封闭非特异性结合位点20min,加入 HMGB1和 GFAP一抗(1∶100)37℃孵育 3h,PBS洗 3次,每次 5min,加 ZF-0313和 ZF-0311二抗(1∶100),此过程后,注意避光操作,37℃孵育 30min,放在摇床上 PBS洗 3次,每次 5min,最后用抗荧光淬灭封片液封片,切片在 Leica sp5激光共聚焦扫描显微镜的倒置显微镜下观察,以检测HMGB1和 GFAP在海马 CA1区表达和共定位。激发发射波长为 488·25的 FITC标记二抗呈绿色荧光,表示高迁移率族蛋白;激发发射波长为 510·40的罗丹明标记山羊抗小鼠 IgG呈红色荧光,表示星形胶质细胞。每张切片随机选择 5个代表视野进入 Image Scan程序进行图像采集,并进行荧光强度测定,取此平均值作为测定值。

2 结 果

2.1 一般情况,术后,脑缺血组大鼠,左前肢不能完全伸直,向左旋转,向左侧倾倒;假手术组无上述表现:两组均出现精神萎靡,进食减少。术后 2d,假手术组精神恢复,反应灵敏,进食增多,缺血组有所改善但相对较差。7d后,缺血组较假手术组反应迟钝。

2.2 HE染色 对照组偶有神经元细胞变性、死亡,大部分细胞形态正常未发现明显病理变化,缺血再灌注组见大量神经细胞变性、坏死、核浓缩、空泡变性。

2.3 GFAP、HMGB1免疫组化检测 假手术组海马 CA1区 GFAP阳性细胞少,胞体小,突起细短,各时间点吸光度值比较 P＞0.05。缺血组 3d时,海马 CA1区GFAP阳性细胞数目增多,胞体增大,染色变深;7d时,星形胶质细胞增生反应达高峰,阳性细胞增多,突起细而长;14d、28d时,星形胶质细胞表达减弱但胞体较大;各时间点吸光度值比较 P＜0.05。假手术组海马 CA1区 HMGB1阳性细胞较少,各时间点吸光度值比较 P＞0.05。缺血组 3d时,HMGB1开始增多,并从核内向核外转移;7d、14d时,HMGB1继续增加,且达峰值,HMGB1大多数位于胞浆及胞外;28d时,HMGB1表达明显下降;各时间点吸光度值比较 P＜0.05(见表1)。

2.4 GFAP、HMGB1免疫荧光标记 假手术组GFAP、HMGB1在各时间点均有少量表达,荧光强度无明显变化(P＞0.05)。缺血再灌组星形胶质细胞单标呈红色,1d、3d、7d荧光强度逐渐增强(与前一时间点比较 P＜0.05);14d开始下降(与前一时间点比较 P＞0.05);28d表达减少(与前一时间点比较 P＞0.05)。 HMGB1单标呈绿色,1d、3d、7d、14d逐渐增强;28d减弱但仍较假手术组强(与前一时间点比较 P＜0.05)。双标可见 GFAP和 HMGB1共表达,共表达呈黄色(见表2)。

2.5 相关性分析 缺血再灌注组 GFAP与HMGB1之间分别作吸光度及荧光强度相关分析:相关系数 r=0.499,P＜0.05;r=0.586,P＜0.05,差异均具有统计学意义,提示两者相关。

表1 各实验组 HMGB1和 GFAP的吸光度值比较±s)

表1 各实验组 HMGB1和 GFAP的吸光度值比较±s)

各时间点比较 F=0.0219,F=117.675,F=0.0436,F=65.157,P＞0.05,P＜0.05,P＞0.05,P＜0.05;HMGB1组:t1=-12.699,P＜0.05;GFAP组:t2=-17.027,P＜0.05,与前一时间点比较#P＞0.05;与前一时间点比较*P＜0.05

再灌注 1d再灌注 3d再灌注 7d再灌注 14d再灌注 28d 666666.14±0.456.37±0.49#6.30±0.42#6.32±0.42#6.20±0.39#6.47±0.548.26±0.79*9.79±1.46*11.27±1.06*7.69±0.53*3.34±0.633.39±0.63#3.32±0.67#3.18±0.56#3.13±0.58#4.11±0.715.16±0.66*6.04±0.63*5.31±0.37*3.86±0.40*

表2 各实验组HMGB1和 GFAP的荧光强度值比较±s)

表2 各实验组HMGB1和 GFAP的荧光强度值比较±s)

各时间点 F=0.0167,F=133.287,F=0.0064,F=9.973,P＞0.05,P＜0.05,P＞0.05,P＜0.05;HMGB1组:t1=10.947,P＜0.05;GFAP组:t2=8.933,P＜0.05,与前一时间点比较#P＞0.05;与前一时间点比较*P＜0.05;与前一时间点比较 ＄P＞0.05;与再灌注 7d比较△P＜0.05

再灌注 1d再灌注 3d再灌注 7d再灌注 14d再灌注 28d 6666649±5.1448±5.57#49±4.86#49±3.61#50±5.15#57.63±4.69118.25±5.52*129±6.52*163±16.19*98±10.14*160±19.93160±17.20#164±15.97#166±16.62#160±18.09#176±30.54204±20.67*233±10.26*215±13.77＄197±12.22＄△

3 讨 论

GFAP是星形胶质细胞的重要中间丝蛋白,目前被用作评估脑损伤后星形胶质细胞反应的标志物,GFAP表达增高以及星形胶质细胞形态学的改变提示星形胶质细胞由静息向活化态转变。本实验缺血再灌注组海马 CA1区星形胶质细胞胞体增大,突起增粗,吸光度及荧光强度增强与假手术组比较差异均具有统计学意义,提示脑缺血再灌注后星形胶质细胞发生活化增生反应,吸光度值提示 7d达高峰而荧光强度值提示高峰壮态可能持续到 14d,此结果与以往的研究一致,假手术组 GFAP平均吸光度及荧光强度均弱于再灌注组(P＜0.05),说明手术创伤引起星形胶质细胞增生活化程度较缺血再灌注为弱。目前研究表明,星形胶质细胞在脑缺血应激链反应的多个环节中,如维持离子稳态、抑制兴奋性氨基酸、清除自由基、提供营养和生长因子、促进新生血管形成、并支持突触再生和神经再生,潜在地影响缺血性损伤的结果;但脑缺血可以导致缺血侧皮层、海马区域的星形胶质细胞活化增生、活化的星形胶质细胞分泌兴奋性介质、炎症因子、Aβ[6]等从而损伤神经细胞,过度增殖的胶质细胞形成胶质瘢痕[7],加重微循环障碍[8],影响神经功能恢复并导致迟发性神经元凋亡[9]。

本研究发现 ,脑缺血时 ,海马 CA1区,1d、3d、7d、14d HMGB1表达逐渐升高,通过平均吸光度及荧光强度分析与假手术组比较具有统计学差异(P＜0.05)。脑缺血早期HMGB1升高主要坏死的细胞产生,被不同的坏死细胞刺激的神经元释放 HMGB1,刺激免疫胶质细胞激活,加剧了 HMGB1从核内向胞外的释放,HMGB1与激活的细胞、兴奋性氨基酸释放互相促进,HMGB1能促进谷氨酸盐从胶质粒释放,增强了兴奋性神经元的死亡,这表明 HMGB1的毒性至少部分通过激活的星形细胞分泌谷氨酸盐,从而增强兴奋性毒性所致神经元死亡。HMGB1通过其受体参与脑缺血损伤的病理过程[10],早期高表达的 HMGB1将导致凝血和抗凝失衡,血脑屏障的破坏[11]。脑缺血后期,HMGB1与受体结合诱导炎症因子产生[12],内皮细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞等活化,尤其是胶质细胞的活化,可能促进 HMGB1高峰的产生。过度表达的 HMGB1将导致血管损伤、动脉硬化、再狭窄、Aβ的神经毒性[13]、迟发性神经元凋亡等[14]。

Hayakawa等[15]认为,脑缺血后期 HMGB1分泌与小胶质细胞的激活有关,理由是:单核巨噬细胞或坏死的细胞在脑缺血的早期阶段 1～3d是增加的,3d后在缺血区凋亡细胞逐渐增加,而凋亡细胞不分泌 HMGB1,HMGB1在第 3天开始增加,第 14天达高峰,因此推断,激活的小胶质细胞分泌 HMGB1。而本文发现在海马 CA1区,HMGB1主要与星形胶质细胞的分泌有关,用免疫组化及免疫荧光法,证实缺血侧海马 CA1区 GFAP及 HMGB1分泌表达在第 3天增多,7～14d处于高峰,28d下降明显但仍较假手术组为高,通过相关性分析,具有相关性。用免疫荧光共聚焦进一步证实在海马 CA1区存有 HMGB1和GFAP共定位细胞,同时发现 GFAP阳性星形胶质细胞周围有 HMGB1的分布,证明星形胶质细胞可分泌HMGB1,此结果与 Kim等[3]研究一致。星形胶质细胞在脑中占绝大多数,海马 CA1区星形胶质细胞产生大量的胞质性磷脂酶 A2,有助于磷脂酰胆碱合成,刺激 HMGB1释放到胞外,同时胞外 HMGB1也促进星形胶质细胞的激活,两者可能形成一种正反馈通路,因此认为 HMGB1后期分泌主要可能与星形胶质的激活有关。

HMGB1与过度激活的星形胶质细胞在脑损伤方面有许多协同作用:引起血管周围增生、再狭窄,导致微循环障碍、增加 Aβ的集聚、加速神经元凋亡等迟发性神经损伤。这提示在临床工作中,对于脑缺血的患者,除了急性发作期的积极主动治疗外,对后期微循环障碍、迟发性神经元死亡及认知功能障碍等慢性损害也不容忽视,应给予相应的神经保护措施。下调 HMGB1表达,减弱星形胶质细胞过度激活,可能对脑缺血治疗尤为重要,可能为未来缺血性卒中治疗策略提供新的思路。

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