补肾法对肾虚排卵抑制模型大鼠妊娠的内分泌激素、脏器湿重及妊娠率的影响

2010-08-22李淑云罗颂平

中国中医基础医学杂志 2010年7期

关键词：动物模型肾虚脏器

李淑云，罗颂平

(广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510000)

补肾法对肾虚排卵抑制模型大鼠妊娠的内分泌激素、脏器湿重及妊娠率的影响

李淑云，罗颂平△

(广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510000)

目的:探讨补肾法对肾虚排卵抑制模型大鼠妊娠的内分泌激素、脏器湿重及妊娠率的影响。方法:采用羟基脲灌胃造肾虚排卵抑制大鼠模型，造模成功后予以罗氏促排卵汤和/或针灸补肾法治疗，治疗后的第6天与雄鼠合笼，合笼后继续治疗10d取出雄鼠，1周后观察大鼠内分泌激素、脏器湿重及妊娠率的情况。结果:治疗后各治疗组大鼠内分泌激素及脏器湿重及妊娠率均有不同程度的增加。结论:补肾法包括补肾复方和/或针刺加电针对肾虚-排卵抑制病理模型大鼠进行治疗，可以有效增加大鼠的妊娠率，但对大鼠其他脏器湿重、内分泌指标的影响无统计学意义。

补肾法;肾虚排卵抑制模型大鼠;内分泌激素、脏器湿重及妊娠率

本研究以SD大鼠肾虚排卵抑制模型为研究工具，以罗氏促排卵汤和/或针灸补肾法为施加因素，研究补肾法对肾虚排卵抑制模型的促排卵作用。通过观察与雄鼠合笼各组大鼠的血清性激素、子宫和卵巢等脏器的湿重、妊娠率，探讨补肾法对排卵障碍性模型大鼠的妊娠影响，为临床治疗提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

10～12周龄、体重220g～250g左右的 SPF级SD大鼠，来源于广州中医药大学实验动物中心。

1.2 药物、试剂

1.2.1 羟基脲鲁卫药准字(2000)第024014号，片剂0.5/片，山东齐鲁兴华制药厂生产，批号20010407。

1.2.2 罗氏促排卵汤方的水提浓缩液罗氏促排卵汤方组方:菟丝子20g，制巴戟15g，淫羊藿10g，当归 10g，党参 20g，炙甘草 6g，熟附子 6g(先煎)，熟地15g，枸杞子20g，加工制作后每毫升含生药量为1.55g/ml。

1.2.3 试剂 E2、P、HCG放免试剂盒，由北京科美东雅生物技术有限公司提供。

1.3 分组

随机将SPF级成熟雌性SD大鼠分为 A组(肾虚排卵抑制模型组)、B组(造模加中药组)、C组(造模加针刺组)、D组(造模加针刺加中药组)、E组(正常对照组)5组。

1.4 方法

1.4.1 造模方法成熟雌性大鼠根据阴道细胞图片确定，并在卵泡早期给予羟基脲灌胃，用生理盐水配制，300mg/kg/d，灌胃第 19天加大药量为500mg/kg/d，固定饲料统一喂养，自由饮水，隔日晨阴道涂片。

1.4.2 造模成功标准隔日进行阴道脱落细胞涂片检查，持续仅观察到核上皮或局化上皮，无周期性变化者;病理改变提示为排卵抑制;观察大鼠的表现:出现拱背，蜷缩少动、反应较为迟钝、体毛疏松不光亮、肌肉松弛、进食量减少等肾虚表现，符合肾虚-排卵抑制的证候与病理特征，则造模成功。

1.5 药物和/或针灸干预

根据分组情况分别给予干预。中药:大鼠药物的用量根据大鼠体重换算公式计算而得。公式:公斤体重剂量(mg/kg)dB=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3(R代表比重系数，B代表大鼠，A代表人)。针灸取穴:取双侧子宫穴、双肾俞穴、中极穴、关元穴，根据不同部位的穴位进针后接电针仪，选用波形、疏密波;电量 15Hz，大小 0.5，加电 10min，将大鼠放入大鼠固定器中，10min后取针。

1.6 采血与取材

药物和/或针灸干预的第6天，将各组大鼠与雄鼠合笼，合笼后继续治疗10d后取出雄鼠，各组大鼠继续自然喂养7d处死，眼眶后静脉取血，保留血清待测激素水平。取血后在无菌条件下处死、解剖，剪取垂体、肾、肾上腺、脾、卵巢、子宫，剔除脂肪，各脏器分别用电子分析天平称湿重。妊娠大鼠记录妊娠胚胎数和胚胎直径。

1.7 观测指标

一般情况如形态、毛色、活动、纳食、大便等。解剖后肉眼观察垂体、肾、肾上腺、脾、卵巢、子宫，电子分析天平称湿重。测定血清促卵泡成熟激素雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(Progesterone，P)、β 绒毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-HCG)定量。妊娠大鼠记录妊娠胚胎数、胚胎直径。

1.8 统计学方法

采用SPSS 11.5统计学分析软件进行数据处理，测定结果以±s表示，采用单因素方差分析，2组间均数比较采用t检验，以P小于0.05作为统计学差异的标准。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

表1 各组大鼠造模前后体重变化(±s，n=12，g)

注:单因素方差分析，同组造模前后比较:*P<0.05， P<0.01;组间比较:同A组比较:#P<0.05，##P<0.01;同E组比较:△P<0.05，△△P<0.01

组别造模前体重造模后体重造模前后体重差A组 220.5±13.66 230.8±36.69△△ 10.3±9.54△△ B组 213.3±12.95 240.0±14.12 30.7±6.13 C组 219.2±10.02 251.9±16.32 32.8±4.32 D 组 213.4± 7.44 232.9±27.25△# 19.4±9.70△ E组 217.0± 8.70 263.1±14.89## 46.1±3.30

2.2 观察体重变化情况

造模成功后进行治疗并合笼，观察治疗前后体重变化。

表2 各组大鼠治疗前与治疗并合笼后体重变化(±s，g)

注:因素方差分析，同组治疗前后比较:*P<0.05， P<0.01;治疗前和治疗后组间比较:同 E组比较:△P<0.05，△△P<0.01

组别 n 治疗前体重治疗后体重治疗前后体重差A组 4 235.5±19.000△△ 268.2±43.980△△ 32.7±26.862 B 组 4 254.5±15.780 335.5±30.610 81.0±32.270 C组 3 251.3± 8.505 299.3±20.232△ 48.0±10.985 D组 4 230.3±18.892△△ 292.3±26.424△△ 62.0± 8.524 E组 6 272.8±19.763 355.2±18.670 82.3±11.498

2.3 各组大鼠脏器湿重情况

2.4 各组大鼠 E2、P、β-HCG

表3 各组大鼠脏器湿重(±s，g)

注:单因素方差分析，治疗后组间比较:同 A组比较:#P<0.05，##P<0.01;同 E组比较:△P<0.05，△△P<0.01;C与 D比较:▲P<0.05，▲▲P<0.01

组别 n 子宫卵巢肾脏肾上腺脾脏脑垂体A组 4 3.116±4.036 0.147±0.042 1.883±0.330 0.068±0.0098 0.863±0.263 0.0097±0.0022 B组 4 6.840±5.700 0.148±0.042 2.084±0.298 0.077±0.0187 0.839±0.127 0.0100±0.0027 C组 3 8.346±3.870#△ 0.159±0.037 2.083±0.122 0.084±0.0171 1.092±0.227 0.0066±0.0089 D组 4 3.516±3.166▲ 0.113±0.018 1.875±0.085 0.078±0.0093 0.849±0.206 0.0080±0.0008 E组 6 6.398±2.440 0.155±0.028 1.981±0.119 0.065±0.0168 0.803±0.098 0.0077±0.0027

表4 各组大鼠E2、P、β-HCG(±s)

2.5 各组大鼠妊娠情况

表5 各组大鼠妊娠情况(±s)

注:因素方差分析，治疗后组间比较:同 A组比较:#P<0.05，##P<0.01;同 E组比较:△P<0.05，△△P<0.01

组别 n 受孕例数胚胎大小(cm) 胚胎数(个) 妊娠率(%)A 组 4 2 0.375±0.479 6.25±7.228△50 B组 4 3 0.800±0.606 8.25±5.560 75 C组 3 3 0.900±0.115 10.50±1.528 100 D组 4 3 0.625±0.479 8.25±5.737 75 E组 6 6 0.833±0.151 14.50±2.074#100

3 讨论与结论

3.1 羟基脲造模方法的选择与使用

羟基脲(Hydroxyurea，简称 HU)，又称羟基脲素，分子式为CH4N2O2，为白色或无色针状结晶，无臭，味微涩，微溶于水及醇，固体干燥状态较稳定，遇水不稳定，血浆最高血药浓度(Tmax)为1h～2h，6h从血中消失，可透过血-脑脊液屏障，20%在肝内代谢，80%由尿排出。羟基脲是一种核苷酸还原酶抑制剂，在核苷酸代谢过程中发挥中心作用，是一种别构酶，是惟一受到高度调控的酶系统。它将二磷酸核苷酸转化为于脱氧核糖核苷酸，参与DNA合成过程中所有前体物的净合成，该酶活力直接影响DNA合成及肿瘤细胞增殖。

现代科学技术对肾虚的研究认为，下丘脑细胞损害和功能紊乱是肾阳虚证的主要病理基础，因其损害引起下丘脑-垂体-肾上腺轴、甲状腺轴、性腺轴不同程度的功能紊乱，同时代谢器官、免疫系统也出现功能和病理的改变，故而肾虚是有物质基础的，是“肾”的功能衰退而引起机体一系列病理变化，包括免疫功能低下、内分泌功能紊乱和三大物质代谢障碍等［1］。因此，用羟基脲造成的肾虚动物模型，是在中医理论指导下建立的具有人类证候表现的动物实验对象，该模型已被广泛认可并使用［2～5］。对于肾阳虚证动物模型造模方法，陈英华等进行了综述研究，认为肾阳虚动物模型主要有两大内容:一是肾阳虚证病理动物模型，主要有肾上腺皮质功能受抑制模型、甲状腺功能受抑制模型、性腺功能受抑制模型、DNA合成抑制肾阳虚模型等;二是肾阳虚证病因动物模型，主要有恐伤肾肾虚动物模型、老年肾虚动物模型、房劳堕胎伤肾肾虚动物模型、先天肾虚动物模型等［6］。

本实验选用羟基脲建立成熟雌性大鼠肾虚排卵抑制模型(给予羟基脲300mg/kg/d，连续18d，第19天开始再给予羟基脲500mg/kg/d，连续11d)。卵巢病理切片卵泡计数结果显示，造模大鼠卵巢组织中次级生长卵泡与成熟卵泡的比例明显减少，而以原始卵泡和初级生长卵泡为主，提示造模成功。

3.2 罗氏促排卵汤药物作用和分析

中医学认为肾主生殖，肾为先天之本，元气之根，主藏精气，在机体的整个生命活动中起着主导作用。肾精包括先天之精与后天之精，为生长发育与生殖之源，故在狭义上又称为“生殖之精”。肾精是妇女月经与胎孕的物质基础。现代中医学家认为，肾在月经产生的机理当中，具有相当于下丘脑-垂体-卵巢轴中下丘脑一级的调节功能，可调控卵巢的排卵及内分泌功能［8、9］。中医名家罗元恺教授认为，不排卵者多数为肾阳虚衰，肾阳虚具有垂体-肾上腺皮质系统功能低下的表现［7］。罗氏促排卵汤的处方药物有:菟丝子、制巴戟、淫羊藿、当归、党参、炙甘草、熟附子、熟地、枸杞子，全方以补肾助阳为主，佐以健脾养血填精，阴阳并重，临床应用于肾阳虚为主的不孕症患者。

本实验SD大鼠羟基脲造模成功后，予以补肾法治疗干预，包括罗氏促排卵汤煎剂、针刺加电针、罗氏促排卵汤煎剂+针刺加电针进行治疗干预，治疗后与雄鼠合笼，可以使治疗各组的大鼠妊娠率增加，子宫、卵巢湿重也有不同程度的增加，特别是针灸组子宫湿重的增加有统计学意义，说明针灸治疗能有效刺激排卵，增加妊娠数从而增加子宫重量。而肾、肾上腺、脾、脑垂体的变化不明显，考虑羟基脲肾虚造模对肾、肾上腺、脾、脑垂体的影响不大，故而治疗干预后各组之间也无明显差异性。模型组大鼠造模成功后，没有其他干预措施，本身有自然恢复倾向，对实验结果有一定影响。

3.3 针灸治疗不孕症

针灸疗法治疗不孕症，历史久远。现代研究提示，针灸治疗不孕症组要通过以下几个途径起作用:①针刺调节下丘脑-垂体-卵巢轴的功能，使内分泌激素水平改变，生殖内分泌功能恢复正常;②针灸可使患者处于低水平的尿17-羟和尿-17酮含量增高，认为针灸有增强肾上腺皮质功能与调节性腺轴的作用;③对于输卵管炎症及阻塞性不孕症，针灸治疗可改善微循环及血流变性质，从而促进炎症、坏死组织的吸收和消退，加快组织的修复和再生，有利于输卵管的通畅。针灸对体内的性激素有双向调节作用，可通过兴奋下丘脑-垂体系统而使性腺激素分泌增加，在此过程中可能有某些神经递质参与，调节促性腺激素释放激素(GnRH)而影响性腺的分泌。针灸疗法对卵巢的影响，可以促进排卵，效果基于一定的雌激素水平，针后出现皮肤温度升高，即交感神经中枢受抑制效果较后。电针可以影响内啡肽物质和下丘脑-垂体-卵巢轴的功能而排卵。许爽君等观察针刺配合补肾调冲中药对治疗功能性无排卵患者的促排卵作用。结果提示，治疗后排卵率达74.8%，基础体温连续测定双相率明显提高，卵泡及子宫内膜生长发育比较显示治疗后比治疗前显著增加，血清雌二醇和孕酮水平亦比治疗前明显提高，这就表明针刺配合补肾调冲中药有较好的促进血清雌二醇和孕酮正常分泌的作用，能明显促进卵泡及子宫内膜的生长发育，有强烈的促排卵、健内膜作用，可显著提高排卵和妊娠率［8］。马瑞芬等对不孕症患者72例采用针刺疗法，观察其促排卵与血相关指标的变化，结果显示针刺可使脉冲频率低者加速而促使卵泡生长排卵，促排卵是通过中枢起效，针刺治疗后血E2水平也有不同程度的上升［9］。

本实验所选穴位包括关元、中极、子宫、肾俞。关元，中极属于任脉，均为任脉与足三阴经的交会穴，位于脐下，邻近胞宫，关元为元阴元阳关藏之处，能调和冲任，通于肝脾肾三经，燮理元阴元阳，取此二穴位既能健脾导滞，又能疏肝理气行瘀，还能补益肾阳肾阴，调和充任气血。肾俞穴为肾的背俞穴，是肾脏精气聚集处，取之能补益肾阳，暖功散寒。子宫穴为治疗妇科疾病的经外奇穴及经验穴，取之能调经种子，理气止痛。本实验选用关元、中极、子宫、肾俞的穴位，均位于腹部及背部，比较容易固定，因大鼠好动依从性差，可以顺利完成针刺和电针操作。本实验结果也提示，针刺治疗何以改善内分泌水平，提高妊娠率，模型组大鼠造模成功后，没有其他干预措施，本身有自然恢复倾向，对实验结果有一定影响。由于样本含量不够大，虽然不同组别大鼠实验结果有变化，但有一些在统计学上差异无显著性。