苦参碱诱导人肺鳞癌SK-MES-1细胞凋亡作用及其可能机制

金晨慈，蒋龙翔

(温州市中西医结合医院 呼吸科，浙江 温州 325000)

苦参碱（MT）是苦参根及苦豆子等中草药的活性成分， 是苦参碱类生物碱的代表，属于四环的噻嗪啶类，具有抗炎、免疫抑制、抗病毒、抗肿瘤等作用[1-2]。国内外研究发现MT对多种肿瘤细胞有一定的杀伤作用[3]。本研究为苦参碱对人肺鳞癌细胞株SK-MES-1增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响， 探讨其对人肺鳞癌可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 苦参碱由西安林海生物工程有限公司提供。RPMI1640、胰蛋白酶及胎牛血清为Gibco产品。四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DM-SO）、牛血清白蛋白（BSA）均为Sigma公司产品。Bcl-2、bax和caspase-3多克隆抗体购自cellsignal公司。

1.2 细胞培养 人肺鳞癌细胞株SK-MES-1购自中科院细胞库，常规培养于含10%新生牛血清的RPMI1640培养液中，置于37 ℃，5% CO2培养箱内传代培养，以0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3 MTT法检测苦参碱对SK-MES-1细胞增殖的影响 取对数生长期的SK-MES-1细胞，消化后重悬，以5×107/L的密度接种到96孔培养板，每孔加100μL细胞悬液。实验设对照组、不同浓度药物组细胞，贴壁后加入不同浓度苦参碱20μL，使其终浓度分别为0、7.5、15、30、60、120、240 mg/L。每组设6个复孔。加入药物后，分别培养24、48、72 h，每孔加入MTT液（5 g/L）10μL，培养4 h后，吸去培养液，每孔加入150μL DM-So，置酶标仪570 nm波长处，测吸光度值，并按下列公式计算细胞增殖抑制率: 细胞增殖抑制(%)=(1-处理组OD570值/空白对照组OD570值)×100%。实验重复3次。

1.4 流式细胞仪检测苦参碱对SK-MES-1细胞凋亡率的影响 取对数生长的细胞以每瓶2×106的密度接种于培养瓶中，细胞贴壁后，弃上清。加入不同浓度苦参碱20μL，使其终浓度分别为0、7.5、15、30、60、120、240 mg/L。孵育48 h后用0.25%胰酶收集所有细胞，用70%乙醇于4 ℃固定30 min，PBS冲洗残留乙醇两次，加入150μL RNase（5 g/L）和150μL PI溶液（50μg/mL）于室温避光染色30 min后，进行流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。

1.5 流式细胞仪检测苦参碱对SK-MES-1细胞周期的影响 取对数生长的细胞以每瓶2×106的密度接种于培养瓶中。24 h后加入不同浓度苦参碱20μL，使其终浓度分别为0、7.5、15、30、60、120、240 mg/L。37 ℃孵育48 h后用胰酶消化成单细胞悬液，PBS冲洗两次，加入10μL PI溶液（20μg/mL）和5μL Annexin V混匀，予室温避光染色15 min后，流式细胞仪检测细胞周期DNA含量分析，确定细胞周期分布。

1.6 染色流式细胞仪检测Bcl-2，bax，caspase-3表达 取对数生长的细胞以每瓶2×106的密度接种于培养瓶中，细胞贴壁后，弃上清。加入不同浓度苦参碱20μL，使其终浓度分别为0、7.5、15、30、60、120、240 mg/L。37 ℃孵育 48 h后收集至10 mL离心管中，PBS洗涤两次。将每管细胞浓度调至（0.5～1）×106/mL。加入4%多聚甲醛，室温固定10 min；加入预冷的90%甲醇（900μL+100μL BSA）破膜；加入一抗室温放置1 h；然后加入FITC标记二抗2μL孵育30 min（避光）。将细胞悬液移入12 mm×75 mm的试管内，以流式细胞仪测FITC的荧光强度。

1.7 统计学处理方法 采用方差分析。

2 结果

2.1 MT对SK-MES-1细胞增殖的抑制作用 MTT法检测结果表明：与对照组相比，苦参碱能显著抑制SK-MES-1细胞的增殖， 并有明显的剂量效应及时间效应关系（见图1）。

图1 SK-MES-1细胞在苦参碱作用下的量效曲线

2.2 MT对SK-MES-1细胞凋亡及细胞周期的影响流式细胞仪检测结果显示：与对照组相比，苦参碱处理后的SK-MES-1细胞凋亡率增加，并与给药浓度成正比。并且SK-MES-1细胞在G0/G1期的比例增高，在S期的比例降低，并有剂量依赖性（见表1）。

表1 不同浓度苦参碱作用SK-MES-1细胞凋亡率和周期时相分布（%）

表2 SK-MES-1细胞相关凋亡蛋白Bcl-2、bax、caspase-3表达比较（荧光强度）

2.3 MT对SK-MES-1细胞蛋白表达的影响 流式细胞仪检测结果表明：与对照组相比，苦参碱处理后的SK-MES-1细胞bax和capase-3表达增强，Bcl-2表达下调，并有剂量依赖性（见表2）。

3 讨论

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其病理类型中又以鳞状上皮细胞癌最常见，约占原发性肺癌的40%～50%。肺癌的治疗是多学科综合的治疗(主要包括外科切除、放射治疗、化学治疗)[4]。目前的常规化疗药物尽管其抑制或杀伤肿瘤细胞的作用肯定，但其毒副作用及多药耐药性难以克服。随着中医对肺癌认识的深入，中医药在改善肺癌患者症状、提高患者生存质量、延长生存期及配合西医增效减毒等方面的优势得到了认同[5]。

苦参碱具有多种生物活性，对于胃癌[6]、白血病[7]、宫颈癌[8]和肝癌[9]等多种肿瘤细胞具有抑制作用。近年来研究表明：①苦参碱可诱导细胞发生凋亡，其作用效果与浓度呈正相关。苦参碱促使肿瘤细胞凋亡的原因可能是苦参碱影响了肿瘤相关基因的表达[10]。②苦参碱抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化，可使细胞发生S期阻滞。这可能与端粒酶、细胞周期蛋白、增殖相关基因有关。③抗肿瘤细胞黏附与浸润转移[3]。在临床上，代志军等[11]等研究发现，苦参碱能提高中晚期肺鳞癌化疗患者的免疫功能，减轻化疗的毒副作用。

本研究发现，不同浓度苦参碱(7.5、15、30、60、120、240 mg/L)对人肺鳞癌细胞株SK-MES-1有不同程度的增殖抑制作用，且随着作用浓度的增高和作用时间的延长，细胞增殖受抑更为明显，提示苦参碱对SK-MES-1细胞的增殖有抑制作用，并有一定的剂量效应及时间效应关系。通过流式细胞分析发现，7.5、15、30、60、120、240 mg/L苦参碱作用48 h后，可使G0/G1期细胞比例较对照组增多且比例逐渐升高，G2/S期细胞比例减少，存在G0/G1期阻滞。通过以上研究结果， 我们推测：苦参碱可以影响肿瘤细胞内DNA的复制和合成，抑制细胞的正常分裂；抑制细胞进入S期，从而使细胞在G1期堆积，出现G2/M阻滞，阻止细胞进行有丝分裂，从而抑制细胞的增殖。

本研究发现：与对照组相比，苦参碱处理后的SK-MES-1细胞凋亡率增加。Bcl-2是细胞的抗凋亡因子，有稳定线粒体膜，阻止线粒体释放caspase，阻遏氧自由基诱导凋亡信号通路的作用[12]。通常情况下，Bcl-2与促凋亡基因bax结合，以二聚体的形式存在[13]。当Bcl-2减少和bax增加时，细胞易于凋亡，反之细胞免遭凋亡。caspase-3是引起细胞凋亡的具体执行酶，是细胞凋亡的主要效应因子[14]。本研究观察MT可以促进SK-MES-1细胞的bax和capase-3表达，抑制Bcl-2表达，从而说明MT可能通过抑制Bcl-2和激活bax，减少细胞色素C的释放，激活caspase-3进而激活caspase蛋白酶家族，诱导细胞凋亡的发生。然而细胞凋亡是一个多因素参与的复杂过程，其具体机制还需进一步研究。

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