三氧化二砷诱导胃癌细胞凋亡和Bcl-2表型变化的意义

郑亦胡，周蒙滔，单云峰，张启瑜

(温州医学院附属第一医院 普通外科，浙江 温州 325000)

近年来，大量研究证实三氧化二砷在体外对于多种恶性肿瘤细胞具有诱导凋亡作用，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、鼻咽癌、胆囊癌、宫颈癌和子宫内膜癌[1-2]，但是对于三氧化二砷诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制却仍然存在争议。下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达是一种重要的作用机制[2-4]。最新的研究却发现，Bcl-2具有细胞保护和破坏两种表型，其不同的表型被其蛋白构象所调控[5]，这种构象的改变可以使Bcl-2从一个细胞保护作用变成破坏作用。本实验拟研究三氧化二砷是否能够诱导SGC7901胃癌细胞凋亡并观察Bcl-2的表达量和表型的变化，探讨其诱导凋亡的机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 三氧化二砷购自哈尔滨伊达药业公司，浓度：10 mg/10 mL。RPMI1640培养液和胎牛血清购自美国Invitrogen公司。抗Bcl-2 N端兔多抗IgG、抗Bcl-2鼠单抗IgG、抗β-actin鼠单抗IgG1购自美国Santa Cruz公司。抗Bcl-2 BH3结构域抗体购自美国Abgent公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠二抗、Cy3 标记的抗兔IgG、DAPI染料购自碧云天生物研究所。CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所。哺乳动物蛋白抽提试剂购自美国Thermo Scientific公司。聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜购自美国Millipore公司。ECL化学发光检测试剂盒购自美国Pierce公司。

1.2 细胞培养 人胃癌细胞株SGC7901购自中科院上海细胞研究所，予含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，在5% CO2饱和湿度的37 ℃孵箱中培养，细胞长满后经胰酶消化法传代。

1.3 实验设计 首先使用细胞毒检测求得三氧化二砷作用SGC7901胃癌细胞24 h的50%细胞死亡的浓度（IC50），再用IC50的浓度作用SGC7901胃癌细胞，尔后进行细胞核形态分析、Bcl-2表型和Bcl-2表达的检测。

1.4 细胞毒检测 细胞以1.5×104个/cm2的密度接种于100μL的96孔板中预培养24 h。使用含0.1% BSA的RPMI1640培养液培养24 h，使细胞同步化。尔后被不同浓度的三氧化二砷分别处理24 h，利用日本同仁化学研究所生产的CCK-8试剂盒进行细胞毒检测，根据厂家的操作手册进行操作。按公式计算：细胞生长抑制率（%）=（1- 实验组光密度值/对照组光密度值）×100%。

1.5 凋亡细胞核形态分析 细胞以1.5×104个/cm2的密度，接种于6孔板上，使用10μmol/L的三氧化二砷处理24 h。细胞经4%的多聚甲醛固定后，用PBS清洗。在暗室中经1μg/mL的DAPI染色15 min后，使用免疫荧光显微镜进行观察（波长为340～380 nm、放大倍数为1000）。

1.6 Bcl-2的表型观察和检测 细胞以1.5×104个/cm2的密度，接种于6孔板上，使用10μmol/L的三氧化二砷处理24 h。经4%的多聚甲醛固定后，用PBS清洗。使用1%的Triton X-100做透膜处理后，再使用5%的小牛血清蛋白进行封闭，添加一抗（1:50）在4 ℃过夜孵育，然后加入Cy3标记的二抗（1:100）在室温下孵育2 h，最后加入1μg/mL的DAPI复染细胞核。使用免疫荧光显微镜进行观察（放大倍数为1000）。一抗包括：抗Bcl-2 N端抗体、抗Bcl-2 BH3结构域抗体。

1.7 Western Blot蛋白印迹法检测Bcl-2的表达 细胞以1.5×104个/cm2的密度接种于75 cm2大小的培养瓶中，经10μmol/L的三氧化二砷处理24 h。胰酶消化后收集细胞。蛋白抽提方法和Western Blot蛋白印迹法参照美国Pierce公司说明书。使用BCA法测定蛋白浓度，β-actin作为参照。

1.8 统计学处理方法 细胞毒检测获得的数据采用单因素方差分析，Western Blot获得的数据采用t检验。

2 结果

2.1 细胞毒检测 SGC7901细胞经不同浓度的三氧化二砷分别处理24 h后，显示三氧化二砷诱导的死亡表现出对剂量的依赖关系。各浓度间相比差异有显著性（P<0.05）。经三氧化二砷处理24 h，SGC7901细胞50%细胞的死亡浓度（IC50）约为10μmol/L（见图1）。

图1 三氧化二砷对SGC7901细胞毒性的影响

2.2 凋亡的检测 未经三氧化二砷处理的正常细胞细胞核核膜光滑、核质均一；经三氧化二砷处理24 h后的细胞核具有凋亡细胞核的特征性核形态，如细胞核呈折缝样，染色质出现浓缩，核膜破裂，染色质固缩，细胞核裂解为碎块等（见图2）。

图2 细胞核形态分析：A为正常的SGC7901细胞核；B～F为经10μmol/L的三氧化二砷处理24 h后的细胞核

2.3 Bcl-2的表型变化 使用抗Bcl-2 N端的抗体得知SGC7901细胞高度表达Bcl-2总蛋白。未经三氧化二砷处理的细胞使用抗BH3结构域的Bcl-2抗体染色后，显示非常弱的染色，而经三氧化二砷处理24 h后的细胞呈现强的抗BH3结构域的Bcl-2抗体染色（见图3）。

图3 Bcl-2的表型观察和检测：A、B为未经三氧化二砷处理的SGC7901细胞，分别使用抗Bcl-2 N端和抗BH3结构域的抗体进行染色；C为经10μmol/L的三氧化二砷处理24 h后的SGC7901细胞，使用抗BH3结构域的Bcl-2抗体进行染色

2.4 Bcl-2的表达 Bcl-2的表达在三氧化二砷处理前和处理24 h相比差异无显著性（P>0.05）（见图4）。

图4 Western Blot检测SGC7901细胞的Bcl-2表达：Lane 1为未经三氧化二砷处理的细胞；Lane 2为经三氧化二砷处理24 h后的细胞

3 讨论

三氧化二砷除了在新诊断和复发的急性早幼粒白血病中被证实具有疗效外，还可能是极其有希望治疗其他肿瘤的药物。目前已知三氧化二砷可以调节胞内的多种信号传导途径，包括阻止端粒酶的活性、诱导活性氧或者通过胞外的信号传递酶、Akt酶、NF-kB转录因子等抑制促细胞生长的信号途径。三氧化二砷诱导肿瘤细胞的凋亡很大程度上依赖于对Bcl-2的调控。但是，目前对于Bcl-2在肿瘤中所扮演的角色仍然存在争议。总体来说，Bcl-2的高度表达与多种肿瘤对化疗药物的抵抗呈正相关，并且过去的研究显示在多种肿瘤细胞中过度表达Bcl-2是一个不利的预后因素。由于Bcl-2在嗅觉的成神经细胞瘤中普遍表达，通过研究Bcl-2的免疫反应活动和新辅助化疗对肿瘤疗效的相关性，证实Bcl-2的表达可能跟较差的预后存在联系[6]。但是也有研究显示在一些肿瘤中高度的Bcl-2表达却和有利的因素及良好的预后相关。系统性的文献回顾表明在非小细胞肺癌患者的幸存者中，Bcl-2的过度表达是一个良好预后的指标[7]。同样在结直肠癌中，Bcl-2的表达与有利的因素及良好的预后有关[8]，在口腔鳞癌中则与全面提高的生存率有关[9]。因此我们观察到SGC7901细胞经三氧化二砷诱导凋亡后发生Bcl-2表型的变化是一个极其重要的现象并且富有意义。因为长期以来，在研究三氧化二砷对肿瘤细胞的作用时，人们一直把目光停留在Bcl-2表达量的改变上面，未从Bcl-2的表型变化来探讨三氧化二砷诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制，而且目前国内外均鲜有相关文献的报道。我们的研究证实了有两种表型的Bcl-2共存于SGC7901细胞中，经三氧化二砷诱导凋亡后，促生存表型的Bcl-2将会向促凋亡表型的Bcl-2转变。因此我们得出Bcl-2表型的改变可能参与了三氧化二砷诱导SGC7901细胞凋亡作用的结论。同样我们的研究为在一些临床资料中观测到的Bcl-2相反的生物学活动性提供了合理的解释：Bcl-2的表达和预后存在怎样的关系可能主要取决于细胞中促生存的Bcl-2表型和促凋亡的Bcl-2表型的比例，而不是Bcl-2总的表达量。展望未来，我们的研究还为肿瘤的靶向治疗提供了一个新的视角：对于那些高度表达Bcl-2的肿瘤，设计开发针对促进Bcl-2表型转化的药物可能比单纯拮抗Bcl-2的抗肿瘤药物是一个更好的选择。

[1] Shao QS,Ye ZY,Ling ZQ,et al.Cell cycle arrest and apoptotic cell death in cultured human gastric carcinoma cells mediated by arsenic trioxide[J].World J Gastroenterol,2005,11(22):3451-3456.

[2] Ai Z,Lu W,Qin X.Arsenic trioxide induces gallbladder carcinoma cell apoptosis via downregulation of Bcl-2[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,348(3):1075-1081.

[3] Scholz C,Richter A,Lehmann M,et al.Arsenic trioxide induces regulated, death receptor-independent cell death through a Bcl-2-controlled pathway[J].Oncogene,2005,24(47):7031-7042.

[4] Bairey O,Vanichkin A,Shpilberg O.Arsenic-trioxide-induced apoptosis of chronic lymphocytic leukemia cells[J].Int J Lab Hematol,2010,32(1 Pt1):77-85.

[5] Lin B,Kolluri SK,Lin F,et al.Conversion of Bcl-2 from protector to killer by interaction with nuclear orphan receptor Nur77/TR3[J].Cell,2004,116(4):527-540.

[6] Kim JW,Kong IG,Lee CH,et al.Expression of Bcl-2 in olfactory neuroblastoma and its association with chemotherapy and survival[J].Otolaryngol Head Neck Surg,2008,139(5):708-712.

[7] Martin B,Paesmans M,Berghmans T,et al.Role of Bcl-2 as a prognostic factor for survival in lung cancer: a systematic review of the literature with meta-analysis[J].Br J Cancer,2003,89(1):55-64.

[8] Kondo E,Miyake T,Shibata M,et al.Expression of phosphorylated Ser70 of Bcl-2 correlates with malignancy in human colorectal neoplasms[J].Clin Cancer Res,2005,11(20):7255-7263.

[9] Lo Muzio L,Falaschini S,Farina A,et al.Bcl-2 as prognostic factor in head and neck squamous cell carcinoma[J].Oncol Res,2005,15(5):249-255.