蓝氏贾第鞭毛虫滋养体染色体扫描电镜观察*

沈海娥,李 冀,路 瑶,张文丽,任兴波,布仁满都呼,田喜凤

2.北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083;

3.华北煤炭医学院中心实验室电镜室,唐山 063000;

4.华北煤炭医学院生物科学系生物技术专业,唐山063000

蓝氏贾第鞭毛虫滋养体染色体扫描电镜观察*

沈海娥1,李 冀1,路 瑶2,张文丽3,任兴波4,布仁满都呼4,田喜凤1

目的电镜观察蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的染色体数目及形态。方法 用改良TYI-S-33培养基培养贾第虫滋养体。制备分散度较好的染色体玻片标本,对玻片标本进行扫描电镜常规处理,扫描电镜观察。结果 在扫描电镜下观察到了蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的染色体,染色体数目为2n=10条,1号染色体为亚中央着丝粒染色体,2号、3号、4号、5号为端着丝粒染色体。结论 通过电镜观察认为蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的染色体核型公式为2n=10=2sm+8t。

蓝氏贾第鞭毛虫;滋养体;染色体;扫描电镜

2.北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083;

3.华北煤炭医学院中心实验室电镜室,唐山 063000;

4.华北煤炭医学院生物科学系生物技术专业,唐山063000

蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)的滋养体寄生于人体小肠,导致以腹泻和营养不良为主要临床表现的蓝氏贾第虫鞭毛虫病。贾第虫是一种单细胞真核生物,是目前所知的最原始的真核生物。由于特殊的进化地位,国内外许多学者都热衷于它的细胞学研究,以探讨原核细胞和真核细胞的进化。从1952年起,国内外学者就对其是否具有典型染色体以及染色体的数目展开了研究〔1〕。

本实验室在光学显微镜下初步观察到了贾第虫滋养体的染色体,但染色体体积微小,呈点状,属于微小染色体〔2〕,所以关于染色体的形态还不甚清楚。近年来,应用扫描电镜研究人类和动物的染色体日益增多〔3-4〕,利用扫描电镜观察染色体特别是微小染色体的数目、形态、结构等核型的观察提供了新途径。本研究应用扫描电镜首次观察了贾第虫滋养体的染色体,并对其核型进行了初步分析,现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1 虫株 选用蓝氏贾第鞭毛虫C2株。基因型属于第3型(GS)。该株虫体系分离自我国四川省农村1名腹泻患儿〔5〕,随后用改良T YI-S-33培养基建立的纯培养〔6〕。虫株由首都医科大学寄生虫教研室用液氮冷冻保种。实验前,将冻存的滋养体复苏,置上述培养基内于37℃培养、传代。

1.2 染色体标本制备 取虫体生长旺盛的培养管,弃去旧培养基,加入含秋水仙素的新鲜培养基(秋水仙素终浓度为 0.2μ g/mL),继续于 37℃培养 4～5h。终止培养后,常温下用力震荡培养瓶,使贴于管壁的虫体脱落。然后收集细胞,0.075 mol/L KCl溶液低渗,固定液(甲醇:冰醋酸的体积比为3∶1)固定,离心收集细胞进行滴片,在37℃水浴锅中用Giemsa染液染色1h,自来水冲洗,晾干〔2〕。

1.3 显微镜观察 将染色玻片用油镜观察。从染色体标本中选取分散较好的中期分裂相细胞。在分裂相周围作2mm直径的标记,以便扫描电镜观察。

1.4 扫描电镜标本制备 按 Harrison〔3〕的方法,依次:3∶1甲醇-冰乙酸脱色,用磷酸缓冲液洗。2.5%戊二醛固定30min。0.1 mol/L(pH7.4)PBS漂洗3次。1%锇酸固定 5min。蒸馏水洗 3次。2%单宁酸处理5 min。蒸馏水洗3次。1%锇酸处理10 min。水洗 3次。30%-100%乙醇逐级脱水,每级5min。临界点干燥(也可用空气干燥)。把标本片标记的核型所在处用玻璃切下约5×5mm2,置日立E-1010型离子溅射仪中喷金。

1.5 扫描电镜观察 KYKY-2800扫描电镜观察。选择5个分散良好的分裂相,用游标卡尺直接测量染色体长度。计算5对染色体的相对长度、臂比值。按照染色体大小和形态依次配对、编号、排核型图,翻拍,放大。

2 结 果

2.1 光学显微镜观察贾第虫滋养体细胞核轮廓已不清晰,核内外有分散的染色体,染色体数目为10条,染色体体积微小,呈粗大的点状或短棒状(图1左侧细胞核)。

2.2 扫描电镜观察

2.2.1 染色体数目 两个细胞核轮廓清晰,内有分散的染色体,见图2。两个细胞核的染色体都溢到核外,左侧一组染色体分散良好,形态清晰。核内染色体数目为2n=10条,见图3。综合光学显微镜和扫描电镜观察结果证明贾第虫滋养体每个核内染色体数目为2n=10条,为二倍体。

2.2.2 染色体相对长度组成及核型分析经测量分析可将贾第虫滋养体的10条染色体配为5对,染色体平均长度为 0.76μ m,为微小染色体,见表1。根据染色体核型的相对长度、臂比值及着丝粒的位置进行分析,剪贴,配对制成核型图,见图4。该核型中1号染色体为亚中央着丝粒染色体,2-5号为端着丝粒染色体。其核型公式是2n=10=2sm+8t。根据核型图绘制核型模式图,见图5。

图1 染色体体积微小,呈短棒状(×1 000)光镜下Fig.1 The chromosomes are short rod in shape and the size is tiny(×1000)light microscope图2 两个细胞核轮廓清晰,内有分散的染色体(×5000)扫描电镜下Fig.2 There are scattered chromosomes in the two nuclei with clear outline(×5000)scanning electron microscopy图3 两个细胞核的染色体都溢到核外,左侧一组染色体分散良好,形态清晰(×5000)Fig.3 Chromosomes are outside of the two nuclei,the left of a group of chromosome is well-dispersed and the morphology is clear(×5000)图4 蓝氏贾第鞭毛虫滋养体染色体中期分裂相及核型图Fig.4 Metaphase chromosomes and the karyotype of Giardia lambliab trophozoite图5 蓝氏贾第鞭毛虫滋养体染色体核型模式图Fig.5 Idiogram of Giardia lambliab trophozoite

表1 蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的核型指数Tab.1 Relative length,arm ratio,classified set of chromosome of Giardia lamblia

3 讨 论

90年代国内学者利用电镜对蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的核分裂进行了初步观察,发现核分裂过程最主要的特征是无凝聚的典型中期染色体出现〔7〕。但随后吴刚等人利用SDS凝胶电泳证实蓝氏贾第鞭毛虫滋养体已存在5种组蛋白〔8〕,陈泳宏等人采用改进的染色质铺展技术制备核小体并进行透射电镜观察,结果表明蓝氏贾第鞭毛虫滋养体已有了直径约10nm的核小体结构〔9〕,Adam等确定了端粒的序列为TAGGG,存在于贾第虫所有染色体分子上〔10〕,这些研究在分子水平上间接证明了具有染色体的可能性。作者在实验室经过长期的摸索和试验,首次在光学显微镜和扫描电镜下观察到成形的蓝氏贾第鞭毛虫滋养体C2株染色体。

Le Blancq〔11〕和 Adam〔12〕等用脉冲场凝胶电泳对WB株全基因组DNA进行分析,根据实验结果推测每个细胞核内至少有5条不同长度的染色体。但关于细胞核是几倍体还尚未定论。Fan等1991年对限制性酶解的蓝氏贾第鞭毛虫滋养体DNA片段进行密度扫描,推测其为单倍体,染色体数目为5条〔13〕。Adam从其每个染色体的分子量和总的分子量相比较认为其为多倍体〔14〕。Bernander等利用流式细胞仪和荧光显微镜研究认为在滋养体阶段每一个细胞核都为二倍体,而不是单倍体〔15〕。截至目前,基本认同的观点是贾第虫滋养体至少含有5条不同长度的染色体。作者经过对大量的分裂相细胞进行观察统计,初步认为贾第虫C2株每一个细胞核内含有10条染色体,根据染色体体积大小、形态、染色等特征推测其为二倍体(2n),并进行了初步的配对和编号。

在实验过程中偶尔发现两个细胞核内的染色体数不一样,见图1,例如一侧为10条,另一侧为 9条或8条,原因可能是:制片中染色体溢出核外,部分染色体丢失,导致2个细胞核的染色体数不同;在数次细胞分裂过程中染色体发生断裂,一侧细胞核的染色体发生丢失,最终两个核的染色体数不同。此现象还需进一步实验观察。

Adam等用脉冲场凝胶电泳对WB株全基因组DNA进行分析,推测蓝氏贾第鞭毛虫滋养体每个细胞核内至少有5条不同长度的染色体,同时推测了每一条染色体的大小,1和2号染色体长度各为1.6Mb,3号为1.6Mb,4号为3.0Mb,5号为3.8Mb,单倍体基因组不超过12Mb〔14〕,最小的染色体定为1号,由小到大依次编号。而我们则按照核型的常规规定,体积最大的染色体定为1号,按体积大小依次编号,所以我们对染色体的编号正好与Adam相反,我们所定的1号染色体即Adam的5号染色体,其它以此类推。

在扫描电镜下观察发现1号染色体为亚中央着丝粒染色体,2-5号为端着丝粒染色体。由于染色体体积微小,在光学显微镜下呈粗大的点状,对于一些常见的染色体分带技术如显示次缢痕的N带、常规的G显带技术无法有效的应用,所以有关染色体的详细特征比如有无次缢痕,有无随体,有无核仁组织区还需进一步研究。

〔1〕Filice FP.Studies on the cy tology and life history of aGiardiafrom the laboratory rat〔J〕.Univ Calif Public Zool,1952,57:53-146.

〔2〕沈海娥,李冀,田喜凤,等.蓝氏贾第鞭毛虫染色体核型初步观察〔J〕.中国人兽共患病学报,2009,25(4):352-353.

〔3〕Harrison CJ,Britch M,Allen TD,et al.Scanning electron microscopy of the G-banded human karyotype〔J〕.Exp Cell Res,1981,134(1):141-53.

〔4〕秦志辉,周洪福,孟阳春.两种硬蜱的染色体扫描电镜观察初报〔J〕.苏州医学院学报,1991,11(1):4-6.

〔5〕祝虹,卢思奇,郭增柱,等.蓝氏贾第鞭毛虫四川株纯培养的建立〔J〕.中国寄生虫病防治杂志,1992,5:42-44.

〔6〕Keister,DB.Axenic culture ofGiardia lambliain TYI-SS-33 medium supplemented with bile〔J〕.T ran R SocT rop Med Hug,1983,77(4):487-488.

〔7〕沈剑钊,李靖炎,卢思奇.源真核生物蓝氏贾第虫核分裂的初步观察〔J〕.动物学研究,1996,17(3):295-299.

〔8〕吴刚,李靖炎,卢思奇.蓝氏贾第虫组蛋白的初步研究〔J〕.动物学研究,1996,17(3):301-305.

〔9〕陈泳宏,郭建,李静炎,等.蓝氏贾第虫核小体的初步研究〔J〕.动物学杂志,2003,38(5)68-70.

〔10〕R D Adam,T E Nash,T E Wellems.T elomeric location of Giardia rDNA genes〔J〕.M ol Cell Biol,1991,11(6):3326-3330.

〔11〕Le Blancq,S M,Adam R D.Structural basis of kary otype heterogeneity ofGiardia Lamblia〔J〕.Mol Biochem Parasitol,1998,97:199-208.

〔12〕Adam R D.TheGiardia Lambliagenome〔J〕.Int J Parasitol,2000,30:475-484.

〔13〕Fan J B,S H Korman,C R Canter,et al.Giardia Lamblia,Hapoid genome size determined by pulsed field gel electrophoresis is less than 12Mb〔J〕.Nucleic Acids Res,1991,19:1905-1908.

〔14〕Adam R D.T he biology ofGiardia spp〔J〕.Microbiol Rev,1991,55(4):706-732.

〔15〕Bernander R,Palm JE,Svard SG.Genome ploidy in different stages of theGiardia lamblialife cy cle〔J〕.Cell Microbiol,2001,3(1):55-62.

Scanning electron microscope observation on chromosome ofGiardia lambliatrophozoite

SHEN Hai-e1,LI Ji1,LU Yao2,ZHANG Wen-li3,REN Xing-bo4,Burenmanduhu4,TIAN Xi-feng1

(1.Department of Biological Science,North China Coal Medical University;
2.Biosciences and Biotechnology of Beijng Forestry University,Beijing100083;
3.Electron Microscopy Room,Central Laboratory,North China Coal Medical University;
4.Bio-technology,Biosciences Department of North China Coal Medical University,Tangshan063000,China)

In order to observe the quantity for chromosome and shape ofGiardia lambliatrophozoites under scanning electron microscopy,trophozoites were culturedin modified TYI-S-33 medium at 37℃and chromosome slides with better dispersion were prepared.Chromosome on the conventional treatment processed slide was observed under scanning electron microscopy.The chromosome ofGiardia lambliatrophozoite was observed with a quantity of 2n=10.The pair 1 was submetacentric chromosome,while the pair 2,3,4 and 5 were all telocentric chromosomes.It＇s demonstrated that the karyogram formula is 2n=10=2sm+8t under scanning electron microscope.

Giardia lamblia;trophozoite;chromosome;scanning electron microscopy

R382.2

B

1002-2694(2010)07-0696-03

*国家自然科学基金(No.30970313)资助

田喜凤,Email:tstianxifeng@163.com

1.华北煤炭医学院生物科学系,唐山 063000;

2010-01-28;

2010-05-11