CD55高表达在分离乳腺癌SP细胞中的作用研究

徐静娴，刘冰阳，森井英一，青世克之，贾心善，张劲松

（1.中国医科大学 附属第四医院眼科中心，眼科医院，辽宁省晶状体学重点实验室，沈阳 110005；2.中国医科大学 第93期临床医学7年制，沈阳 110001；3.大阪大学医学院病态病理教研室，日本 大阪 565-0871；4.中国医科大学 基础医学院病理学教研室，沈阳 110001）

癌干细胞是一小群具有在琼脂培养基中培养形成克隆，在体内移植分析中形成肿瘤的能力的细胞。癌干细胞最初发现于白血病［1］。近期研究发现，在长期培养的某些细胞株中也存在癌干细胞［2］。荧光染料Hoechst 33342对普通的癌细胞具有着色作用，但具有干细胞特性的癌细胞对该染料却具有排除能力，因此应用Hoechst 33342染色可分离癌干细胞。在荧光激活细胞分选分析中，带有较低水平Hoechst 33342染色的细胞被看作是具有癌干细胞特性的SP（side-population）细胞，相反，带有较高水平Hoechst 33342染色的细胞被看做是非SP细胞，即MP（main-population）细胞，不具有癌干细胞的特性。Kondo等［2］报告只有SP细胞既能生成SP细胞又能生成MP细胞，而MP细胞不具备这种能力。目前，利用SP细胞分选法来分离干细胞的方法已广泛应用于气管干细胞、肺癌干细胞的研究中［3］。

癌干细胞对凋亡具有抵抗性，但其机制目前尚不清楚。对癌干细胞进行抗凋亡能力分析困难的原因之一，就是分离癌干细胞时使用的Hoechst 33342染料具有能够诱导凋亡的毒性作用［4］。应用荧光激活细胞分选分离出来的SP细胞内包含的Hoechst 33342量比MP细胞低，SP细胞对凋亡的耐受性可能归因于Hoechst 33342的低含量，而非SP细胞本身的特性。因此，为了精确评估凋亡，SP细胞应使用不含有Hoechst 33342的系统进行分离。本研究以人类乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB-231为研究对象，应用Hoechst 33342染色及抗CD55抗体染色，分离出SP和MP细胞、CD55高表达（CD55hi）和CD55低表达（CD55lo）细胞，对比了2群细胞的特性，探讨了应用抗CD55抗体染色替代Hoechst 33342染色来分离乳腺癌SP细胞的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

人类乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB-231分别购自美国细胞中心（Rockville，美国）和日本科学研究资源库（HSRRB，日本）。培养于含10%胎牛血清（FCS）的 DMEM（Sigma，美国）培养基中。

1.2 方法

1.2.1 分选SP、MP细胞：采用Goodell等［5］分离SP细胞的方法，将细胞以1×106/ml的浓度加入2组培养基中∶第一组培养基中含Hoechst 33342 5 mg/ml，第二组培养基中除了5 mg/mlHoechst 33342外，另加入了戊酸丙胺（verapamil，50 mmol/ml）。37℃培养90 min后，收集细胞。应用含有三维激光的FACSVantage（Becton Dickinson公司，美国）进行分析，识别SP及MP细胞，分离并收集。

1.2.2 分选CD55hi、CD55lo细胞：将细胞以1×106/ml的浓度加入含2%FCS的PBS溶液中，再加入藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的浓度为 5 ml/ml的抗CD55抗体（Immunotech公司，法国），避光染色30 min后，应用FACS Vantage SE分析，确定CD55hi与CD55lo细胞，分离并收集。

1.2.3 测定存活细胞比例：清洗细胞，用不含血清的DMEM悬浮，在96孔培养板中（5×103/孔）培养12或24 h后，行台盼蓝染色，通过随机计数5×102个细胞计算台盼蓝阴性细胞的比例。

1.2.4 体外克隆形成分析：用0.1 ml的含10%FCS的DMEM培养基悬浮清洗后的细胞，分别计数200个细胞，放入1 ml含15%FCS的DMEM的甲基纤维素培养基中培养14 d后，计数克隆形成的数目。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件，数据均以±s表示，采用t检验进行统计学分析，P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SP、MP细胞的分选

用Hoechst 33342染色并应用FACS-Vantage仪分析分选MCF7细胞，结果显示SP细胞占3.9%（图1A），在含有戊酸丙胺的溶液中，SP细胞比例明显降低（从3.9%降至0.03%）（图1B）。对分选后的SP和MP细胞再行抗CD55抗体染色，可见SP和MP细胞分别位于CD55hi和CD55lo区域（图1D）。

2.2 CD55hi、CD55lo细胞的分选

MCF7细胞用抗CD55抗体染色后被分别作为CD55hi和CD55lo细胞分选出来。CD55hi细胞的比例约占0.8%～1.3%。对分选出的CD55hi和CD55lo细胞行Hoechst 33342再染色，可见分别位于SP和MP区域中（图2A～C）。

2.3 血清缺失诱导凋亡分析

对MCF7细胞的SP和MP细胞进行分选、清洗后，用不含血清的试剂悬浮，测定到SP细胞中存活细胞的比例（12 h时为93%，24 h时为65%）比MP细胞中（12 h时为79%，24 h时为34%）高（图1C，P<0.01），表明在血清缺失的情况下，SP细胞比MP细胞存活时间长。同样，在血清缺失的情况下，甄选出的CD55hi细胞也比CD55lo细胞存活时间长（图2D）。

2.4 克隆形成能力分析

在含有15%FCS的含甲基纤维素的DMEM培养基中加入CD55hi和CD55lo细胞，CD55hi细胞所形成的克隆数（51.0±5.8）明显多于CD55lo细胞（5.3±2.3）（P<0.01）。

2.5 MDA-MB-231细胞株的检测结果

我们同时对乳腺癌细胞株MDA-MB-231也进行了SP、MP细胞及CD55hi、CD55lo细胞的分选及血清缺失诱导凋亡耐受性的分析，结果与MCF7细胞相似。

3 讨论

目前，适合SP细胞分离的表面标记还很有限。ATP结合转运蛋白G超家族成员2（ATP-binding cassette transporter G2，ABCG2）是骨髓 SP 细胞的标志，然而ABCG2敲除鼠并没有完全丧失乳腺SP细胞［6］。我们预测SP细胞一定能够表达某种表面分子，并起到保护细胞免受外源伤害刺激的作用。CD55可能就是这种合适的分子之一。CD55是一种补体调节蛋白，它能够防止补体因子在细胞表面的蓄积［7］，在保护癌干细胞免受免疫系统攻击方面可能起重要作用。CD55的过度表达也是结肠癌愈后不良的可靠指征［8］，在巨大淋巴瘤中，CD55的表达水平与肿瘤的大小及耐药性呈正相关［9］，在SCID鼠中，CD55的表达敲除降低了前列腺癌细胞株的肿瘤起源性［10］。

本研究根据CD55的表达水平成功分离出了乳腺癌SP和MP细胞。实验结果表明，2种乳腺癌细胞株中SP细胞的CD55为高表达；分选的CD55hi和CD55lo细胞，再用Hoechst 33342染色时，分别位于SP和MP区域中；分选的SP和MP细胞，再用抗CD55抗体染色时，则分别位于CD55hi和CD55lo区域中；在血清缺失的情况下，CD55hi和CD55lo细胞分别显示了与SP和MP细胞相似的行为，即CD55hi细胞与SP细胞在体外同样显示出对血清缺失诱导凋亡的高耐受性；CD55hi细胞较CD55lo细胞在体外具有更强的克隆形成能力。综上所述，在乳腺癌中，CD55hi和CD55lo细胞分别可以代替SP和MP细胞，即应用细胞CD55高表达的特性可以替代Hoechst 33342染色来分离乳腺癌SP细胞。

本研究结果提示，CD55hi（SP）细胞比CD55lo（MP）细胞对凋亡刺激具有更高的抵抗性。因此，CD55可以推测为乳腺癌干细胞的一个表面标志，有可能成为针对癌干细胞治疗的一个新的靶点。进一步的研究（包括分离CD55hi细胞、评估其肿瘤起源性）将会更深入揭示在癌干细胞分离中CD55高表达的作用。

［1］Lessard J，Sauvageau G.Bmi-1 determined the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells ［J］.Nature，2003，423（6937）：255-260.

［2］Kondo T，Setoguchi T，Taga T.Persistence of a small subpopulation of cancerstem-likecellsintheC6gliomacellline［J］.ProcNatlAcad Sci USA，2004，101（3）：781-786.

［3］Song N，Jia XS，Jia LL，et al.Expression and role of Oct3/4，Nanog，Sox2 in the regeneration of rat tracheal epithelium ［J］.Cell Prolif，2010，43（1）：49-55.

［4］Zhang X，Chen J，Davis B，et al.Hoechst 33342 induces apoptosis in HL-60 cells and inhibits topoisomerase I in vivo［J］.Arch Pathol Lab Med，1999，123（10）：921-927.

［5］Goodell MA，Brose K，Paradis G，et al.Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo［J］.J Exp Med，1996，183（4）：1797-1806.

［6］Jonker JW，Freeman J，Bolscher E，et al.Contribution of the ABC transporters bcrp1 and mdr1a/1b to the side population phenotype in mammary gland and bone marrow of mice［J］.Stem Cells，2005，23（8）：1059-1065.

［7］Spendlove I，Ramage JM，Bradley R，et al.Complement decay accelerating factor （DAF）/CD55 in cancer［J］.Cancer Immunol Immunother，2006，55（8）：987-995.

［8］Durrant LG，Chapman MA，Buckley DJ，et al.Enhanced expression of the complement regulatory protein CD55 predicts a poor prognosis in colorectal cancer patients ［J］.Cancer Immunol Immunother，2003，52（10）：638-642.

［9］Terui Y，Sakurai T，Mishima Y，et al.，Blockade of bulky lymphomaassociated CD55 expression by RNA interference overcomes resistance to complement-dependent cytotoxicity with rituximab［J］.Cancer Sci，2006，97（1）：72-79.

［10］Loberg RD，Day LL，Dunn R，et al.Inhibition of decay-accelerating factor（CD55）attenuates prostate cancer growth and survival in vivo［J］.Neoplasia，2006，8（1）：69-78.