乳酸测定在诊断线粒体病中的应用研究

郑宗富,刘奇才,刘永平,徐国焱,陈少华

(1.南京军区福州总院476医院,福建福州 350002;2.福建医科大学附属第一医院)

乳酸测定在诊断线粒体病中的应用研究

郑宗富1,刘奇才2,刘永平1,徐国焱2,陈少华1

(1.南京军区福州总院476医院,福建福州 350002;2.福建医科大学附属第一医院)

目的探讨血液中的乳酸水平能否成为线粒体基因突变患者的筛查指标。方法选择2型糖尿病(2-DM)530例,横纹肌病33例,耳聋162例,健康对照120例,检测受试者血液中的乳酸水平,并行线粒体基因组DNA分析,采用PCR-RELP技术进行常见的线粒体突变位点筛查(mtDNAtRNAleu(uur)A1555G和mtDNAtRNAleu(uur)A7444G)和测序。结果线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)突变组(2-DM、耳聋和横纹肌病)的乳酸水平与mtDNA正常组及对照组比较均存在显著差异(P＜0.05)。在162例耳聋患者中筛查出3个线粒体性耳聋家系(51人);530例糖尿病患者中筛查出一个G7444A突变的糖尿病家系(27人);33例肌病患者中筛查出1例线粒体肌病患者,而在对照组中未见mtDNA异常。结论乳酸检测虽是线粒体病的非特异性指标,但能用于线粒体基因突变的早期筛查。

乳酸;线粒基因;突变

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0071)

目前国内外对线粒体病的诊断缺乏统一标准,现行的诊断主要依据临床资料、肌肉活检、线粒体酶复合体分析、线粒体呼吸测定、电镜病理和组织化学检查等[1],但上述方法并不适用于线粒体病早期筛查和早期诊断。近年,寻求线粒体病早期诊断的实验室指标已成为各国学者研究的热点。本研究选取与线粒体基因突变关系密切的相关疾病即糖尿病(DM)、耳聋和肌病患者为研究对象,分析其临床特征及其血液中的乳酸水平,并通过PCR-RELP技术验证其存在线粒体基因突变的方法来说明血液乳酸检测在筛查线粒体病中的作用。

1 资料与方法

1.1 对象

选取2005年6月至2007年12月间来我院及福建医大附属第一医院就诊的2型糖尿病(2-DM)患者530例、横纹肌病33例、耳聋162例,作为疾病组;并选择健康体检者120名作为对照组,其空腹及餐后2 h血糖均正常,排除DM、耳聋、肌病家族史。

1.2 仪器试剂和方法

1.2.1 生化指标测定 空腹血糖用Hitachi7060或OlmypusAU2700全自动生化分析测定仪检测,血乳酸用美国强生V250干化学分析仪检测。

1.2.2 线粒体DNA(mitochondria DNA,mtDNA)分析抽静脉血1.8 ml,EDTA抗凝,蛋白酶K快速裂解法提取外周血总基因组DNA。

(1)mtDNA7444A→G突变检测,扩增体系:模板2 μ l,引物[2]由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成 ,2.5 μ mol/L,上 游 :5′-CATATTCATCGGCGTAAATC-3′0.6 μ l;下游 :5′-GGTTCTCAGGGTTTGTT ATA-3′0.6 μ l,dNTP 10 mM 0.5 μ l,10 ×PCR 缓冲液2.5 μ l,Mg2+(25 mmol/L)2.0 μ l,Taq 酶 5 U/μ l(Promega公司)0.2 μ l,ddH2O 16.6 μ l。PCR 条件 :95℃5 min预变性,35个循环(94℃60 s变性,58℃60 s退火,72℃60 s延伸),72℃7 min终末延伸;取扩增产物12 μ l,用限制性核酸内切酶 XbaⅠ10 U(Promega公司),上样缓冲液:2 μ l以2%琼脂凝胶110V、25 mA电泳30 min,用溴化乙锭(EB)染色后紫外灯下观察。

(2)mtDNA1555A→G突变检测:mtDNA1555位点引物为 nt1278-1298:5′-CCCTGATGAAGGCTACAAA GT-3′和 nt2018-1999:5′-CAGCTATCACCAGGCTCGG T-3′由上海生工公司合成。PCR反应体积为25 μ l,含50 ng 样品 DNA、25 μ mol/L引物(上下游)各0.4 μ l、0.2 mmol/L dNTP 0.5 μ l、10 ×PCR 缓冲液 2.5 μ l、2 mmol/L Mg2+、1 U Taq酶(Promega公司)。在PE9700热循环仪上94℃5 min预变性后,94℃60 s→58℃60s→72℃60 s,35个循环,72℃延长10min。限制性核酸内切酶XbaⅠ酶切1小时后1.5%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。

2 结果

mtDNA突变组的性别比例和年龄组成与非突变组比较无显著差异。mtDNA突变组的乳酸水平(其中2-DM 16例、耳聋51例和横纹肌病1例)与mtDNA正常组及对照组比较均存在显著差异(P＜0.05),而mtDNA正常组与对照组比较不存在显著差异(见表1)。在2-DM、横纹肌病、耳聋者中共68例有mtDNA突变,健康对照组未检出mtDNA突变。

表1 疾病组中有或无mtDNA突变者与正常对照组血液乳酸检测结果比较

3 讨论

线粒体是细胞内的重要细胞器,是细胞的供能场所,其通过氧化磷酸化合成ATP供给细胞各种生命活动的需要。mtDNA具有独特的遗传学特性,包括母系遗传、易突变、异质性与阈值效应等特点,1989年Lemkes等首次报道了一个母系遗传伴神经性耳聋的DM家系。1992年Reardon和 van den Ouweland等又分别对有此特点的家系成员进行了基因分析,发现mtDNA编码的基因3243位点处鸟嘌呤(G)取代了腺嘌呤(A),认为该突变是DM的致病基因,与线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(mitochondrialencephalomyopat hywith lactic acidosisand stroke-like episodes,MELAS)患者的突变位点相同[2,3]。线粒体DNA的A3243G基因突变降低了mtDNA编码蛋白的稳定性及相应氨基酸与其tRNA的结合力,从而影响线粒体蛋白质的合成。该点基因突变可致与转录终止因子结合障碍,相邻tRNA生成减少,影响诸线粒体OXPHOS基因翻译,影响骨骼肌OXPHOS功能,糖无氧酵解增加,乳酸生成增多[4]。

1994年,Reid等报道了一个苏格兰大家系,家族中有13名成员有不同程度的感音神经性耳聋,基因分析发现这13名家族成员均有异质性A7445G点突变,不同的研究均表明mtDNA3243A→G突变是线粒体DM中的常见类型,其发病率约1%。由于特殊的生物学环境和遗传特点使mtDNA容易发生突变,并产生DNA异质性,这也是造成该病家族成员具有显著的表型异质性的主要原因。由于所选择的研究对象和条件不同,从不同人种群体研究的情况分析,除存在疾病分布不均的因素外,影响其诊断准确性的最主要因素是mtDNA异质性[5-8]。

剧烈运动后、循环衰竭和呼吸衰竭时,由于组织缺氧,糖酵解增加,乳酸水平会升高;重症肝病、尿毒症、细菌感染、动脉硬化性心脏病、重症贫血时,乳酸水平会升高。以上这些因素均可引起血清中乳酸升高,在筛查线粒体病时应排除这些干扰因素。mtDNA突变组的乳酸水平(2-DM、耳聋和肌无力)显著高于mtDNA正常组及对照组,且在乳酸增高的2-DM、耳聋和肌无力患者中筛查出3个线粒体性耳聋家系(51人)、1个G7444A突变的DM家系(27人)和1例线粒体肌病患者,而在对照组中未筛查出线粒体基因突变的患者。

通过乳酸筛查本文结合PCR-RELP技术验证乳酸增高患者中存在mtDNA异常,对乳酸异常患者的mtDNA分析及描述为研究线粒体DM、线粒体性耳聋等的防治提供了重要参考。

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Lactic acid in screen chondriogene disease

ZHENGZong-fu,LIU Qi-cai,LIU Yong-ping,et al.(No.476hospital of PLA Fujian,Fuzhou350002,China)

ObjectiveTo probe lactic acid in screen chondriogene mutation.MethodsThe lactic acid of patients was collected.And chondriogene mutationwas tested by PCR-RELP(mtDNAtRNAleu(uur)A1555G and mtDNAtRNAleu(uur)A7444G.ResultsThe lactic acid of chondriogene mutation group ishigher than normal control.A G7444A mutation family,three mtDNAtRNAleu(uur)A1555G family and one were found.ConclusionAnalysis of lactic acid can be use in screening chondriogene mutation.

Lactic acid;Chondriogene;Mutation

R596.2

A

1007-4287(2010)01-0071-03

2008-07-09)