利用SELDI-TOF-MS技术分析喉癌患者血清蛋白质谱变化

王秀丽,高春芳,赵 光,盛新华

(解放军第150中心医院全军肛肠外科研究所,河南洛阳 471031)

利用SELDI-TOF-MS技术分析喉癌患者血清蛋白质谱变化

王秀丽,高春芳,赵 光,盛新华

(解放军第150中心医院全军肛肠外科研究所,河南洛阳 471031)

目的筛选喉癌特异性血清蛋白质标志物,建立用于喉癌诊断的分类树模型。方法采集喉癌患者57例与正常人64例的血清,用表面增强激光解吸/电离-飞行时间-质谱分别检测其蛋白表达谱,用Biomarker Wizard软件筛选出差异蛋白,再用Biomarker Patterns软件建立喉癌诊断模型,另采集15例喉癌患者及20名正常人的血清对该模型进行盲法验证。结果通过对喉癌患者术前血清与正常人血清蛋白质谱分析,发现有24个蛋白的表达有明显差异(P＜0.05),并建立了由质荷比(M/Z)分别为4 206、6623、8 928和9 424 Da的4种蛋白质组成的分类树诊断模型,准确率为95.0%(115/121),敏感性和特异性分别为94.7%(54/57)、95.3%(61/64)。盲法验证其敏感性为86.7%(13/15),特异性为85.0%(17/20)。分析喉癌患者手术前后血清蛋白质谱的变化,发现术前高表达的8种蛋白质术后表达明显下调。结论喉癌血清蛋白质谱诊断模型具有一定的优越性,为喉癌的早期诊断及预后标志物的筛选提供了新途径。

喉癌;SELDI-TOF-MS;生物学标记;质荷比(M/Z)

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1437)

喉癌是头颈部常见恶性肿瘤之一,近年来其发病率有增高的趋势。喉癌的定位诊断较容易,但在喉癌的早期诊断上仍缺乏有效的生物标志物。近年来肿瘤的蛋白质组学研究取得了长足的进展,尤其是表面增强激光解吸/电离-飞行时间-质谱(Surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技术的出现为寻找肿瘤的生物标志物提供了新的技术平台[1]。本研究通过对喉癌患者与正常人血清差异蛋白的比较,建立了喉癌的血清蛋白质谱诊断模型。

1 材料与方法

1.1 临床资料

本组喉癌病人57例(声门癌22例、声门上癌28例、声门下癌7例),年龄40-72岁,中位年龄57.45岁。其中男性31例,女性 26例。血清标本取自2007年2月-2008年12月在解放军第150中心医院住院的手术患者,均经术后病理确诊,均为不同分化阶段的鳞状细胞癌。正常对照组血清标本64例,取自同期本院健康体检人群。所有病人术前及术后15天清晨空腹无菌采静脉血3 ml,1 000 rpm离心,收集上清分装,-80℃保存。病人组与对照组在性别构成和年龄上无统计学差异。并且三类标本均经实验室检查排除影响血清蛋白质含量的其它相关疾病。

1.2 试剂与仪器

尿素、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、芥子酸(SPA)、三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)、3-环乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)及羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等均购自美国Sigma公司。SELDI蛋白质芯片系统(PBSⅡ-C)及其配套的金属亲和表面(IMAC30)铜离子芯片均购自美国Ciphergen公司。

1.3 方法

1.3.1 血清样品准备 4℃融解血清,1 000 rpm离心10 min;取20 μ l血清,置于1.5 ml离心管中 ;加40 μ l U9 缓冲液(含 9 mol/L尿素 、2%CHAPS 、50mmol/L Tris-HCl,pH9.0);4℃振荡 30 min,使蛋白变性;取20 μ l变性后的样品 ,加入 240 μ l IMAC 结合/洗脱缓冲液(含100 mmol/L磷酸钠、500 mmol/L氯化钠,pH7.0)中,使最后上样的血清稀释约40倍。

1.3.2 芯片预处理及与血清蛋白结合 芯片每孔加100 mmol/L硫酸铜溶液50 μ l,4℃下200 rpm振荡5 min,去除硫酸铜溶液,用去离子水洗涤5次后甩干;每孔中加入100 mmol/L醋酸钠(pH4.0)50 μ l,4℃振荡5 min,去离子水洗涤5次;芯片每孔加入结合/洗脱缓冲液150 μ l,4℃振荡 5 min后除去缓冲液,重复1次。将稀释后的样品取50 μ l加入芯池中,4℃孵育60 min后弃去液体;再用150 μ l结合/洗脱缓冲液冲洗 2次;最后用 1 mmol/L HEPES(pH7.0)快速冲洗。取出芯片,自然风干。在各孔芯池上加入饱和 SPA(取SPA1 mg溶于 15 μ l 50%ACN 、15 μ l 1%TFA 中)2 次 ,每次为 0.5 μ l。风干后上机检测。

1.3.3 芯片检测与数据处理 用加有All-in-one标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪,设定仪器参数。检测时设定SELDI-TOF-MS的激光强度为175,灵敏度为8,收集数据的质荷比(M/Z)范围为2 000-20 000,收集位置 25-75。用 Ciphergen ProteinChip 3.2.0软件自动采集数据,用Biomarker Wizard 3.2.0软件对芯片检测得到的蛋白质相对含量及蛋白质M/Z数据进行处理。

1.3.4 分类树诊断模型的建立 用数据挖掘软件Biomarker Patterns Software 5.0对所得数据分组及相关性进行分析。建立用于喉癌与正常人的最优分类树诊断模型。观察该模型的诊断效能。

2 结果

2.1 喉癌术前组与正常对照组血清样品蛋白质谱的比较

2.1.1 血清蛋白质谱的比较 用Biomarker Wizard软件对57例喉癌患者(术前)和64例正常人的血清蛋白质谱数据进行对比分析,喉癌组与对照组血清样品中有半数蛋白峰的表达量都是基本相同的,但2组之间仍有24个蛋白表达差异具有统计学意义。其中有19个蛋白峰在喉癌组(术前)与对照组比较,差异显著(P＜0.01)。在这19个蛋白中,喉癌组血清中高表达的蛋白占16个;与正常对照组相比较,蛋白表达下调的有3个,表1。

2.1.2 喉癌诊断模型的建立 用Biomarker Patterns软件对检测得到的数据进行数据挖掘,建立了M/Z分别为4 206、6 623、8 928和 9 424等4种蛋白组成的最优分类树诊断模型,图1。该模型中节点1为根节点,包括了所有用于建立模型的受检样本。各节点处的判别函数(各系数与括号内相应蛋白质相对含量的积)分别为:在节点 1处如 -0.565(M4206)-0.825(M8928)≤-7.687,归节点 2,否则为节点4。节点2处如 M9424≤2.252归节点3,否则为终结点3。节点3处如 0.684(M4206)-0.729(M6623)≤2.438归为终节点1,否则归为终结点2。节点4处如M8928≤-0.075归为终结点4,否则为节点5。节点5处如M4206≤-1.652归为终结点5,否则为终结点6。终结点1、6被模型判别为正常人 ,终结点 2、3、4、5 为喉癌 。

2.1.3 分类树模型对喉癌的诊断效率 分类树模型在学习模式下对57例喉癌患者、64例正常人进行分组,准确率为96.7%(117/121),灵敏度和特异性分别为96.5%(55/57)、96.9%(62/64);在测试模式下对上述样本进行分组,其准确率为94.2%(114/121),灵敏度和特异性分别为94.7%(54/57)、93.8%(60/64)。利用所建立的最优分类树诊断模型验证另外15份喉癌和20份正常对照样品的血清蛋白图谱,敏感性为86.7%(13/15),特异性为85.0%(17/20)。

2.2 喉癌术前与术后血清蛋白质谱的变化

在相同条件及参数下,应用IMAC30蛋白芯片和Biomarker Wizard软件对喉癌术后病人血清分析,并与术前组和正常对照组的蛋白质谱进行对比研究。结果发现术前组19种高表达的蛋白在术后有14种蛋白表达量都有所下降,其中M/Z为6 960、4 206、8 518、13 876、6 960、9 424、14 052、3 910 等 8 种蛋白与正常对照组蛋白峰强度相当,无显著差异,而与术前组比较具有显著差异(P＜0.05)。

图1 喉癌组与对照组血清蛋白图谱分类树模型

表1 喉癌组和对照组血清质谱中差异蛋白表达的比较

3 讨论

喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,发病率约占全身恶性肿瘤的5%[2]。声门型喉癌由于在病程早期就出现声音嘶哑,因此可较早发现病变,声门上癌或声门下癌因早期症状不明显,易延误诊断,治疗效果差,有时很难保留喉功能。因此,喉癌的早期诊断不仅可以彻底切除肿瘤,而且为保留或重建喉功能提供了机会。而从血清中寻找特异性生物标记物用于喉癌的早期诊断是目前的研究热点之一。血清中低分子量蛋白质谱可反映出喉癌各个不同阶段的病理变化,通过对血清标本进行蛋白指纹图谱分析,可能有助于喉癌的早期诊断。

SELDI-TOF-MS技术是蛋白质芯片技术与质谱技术相结合的产物,最先由Hutchens和Yip[3]提出,自Adam、Petricoin等[4,5]将其应用于前列腺癌、卵巢癌的研究以来,已被广泛应用于临床常见恶性肿瘤[6]的研究。该技术在耳鼻咽喉头颈外科方面也有相关的研究。Wadsworth等[7]应用SELDI-TOF-MS技术在99例头颈部鳞状细胞癌患者、25例健康抽烟者及102例正常对照的血清中筛选差异表达蛋白,结果发现33个蛋白质峰与正常组有显著差异。其中相对分子质量为10 068的峰被鉴定为已知肿瘤标记物MPS1。国内肖雪媛等[8]对33例喉癌患者和31例正常人血清应用蛋白芯片进行蛋白质谱分析比较,喉癌患者中有16个差异蛋白(标志分子),其中8个标志分子在喉癌患者中高表达,得出两个相对分子质量8135和2053的蛋白质用于建立喉癌诊断的分类模型。张秀强等[9]对46例喉癌患者血清进行蛋白指纹图谱与正常人比较,结果表明用该技术初步建立的区分喉癌与正常人血清蛋自差异表达模型可以区别喉癌和正常人,同时筛选出喉癌特异相对分子质量4174、5192和4965的蛋白。

本研究采用SELDI-TOF-MS技术对57例喉癌病人和64名正常人进行了血清蛋白质谱对比分析研究,发现喉癌病人与正常人血清中有24个蛋白质峰具有显著差别(P＜0.05)。将两组血清蛋白质谱建立数据库,利用Biomarker Patterns软件建立了以M/Z分别为4 206、6 623、8 928和 9 424等4种蛋白组成的分类树诊断模型,将喉癌病人与正常人正确分组,其正确分组率分别为94.7%(54/57)和95.3%(61/64)。用此模型盲法分析另外15例喉癌患者和20例健康人的血清蛋白质谱,敏感性为86.7%(13/15),特异性为85.0%(17/20)。喉癌病人手术前后血清蛋白质谱比较发现,一些手术前高表达的蛋白质在术后均明显下降,其蛋白质峰强度与正常对照组相当。

我们的研究结果表明,通过SELDI-TOF-MS技术所建立的喉癌的诊断模型具有重要的临床意义,还可以利用该技术进一步筛选预后标志物。也要看到,SELDI-TOF-MS做为质谱的一种,有其自身的劣势,如不适用于大分子量的蛋白质的分析。同时,由于血清蛋白质具有巨大的动态变化范围(＞1010),而我们研究的样本数量有限,对于蛋白质组学在评价喉癌治疗效果中的应用,还需要进一步的深入。

[1]Vermza M,Wright GL,Hanash SM,et al.Proteomic approaches within the NCI early detection research network forthe discovery and identificationof cancer biomarkers[J].Ann N Y Acad Sci,2001,945:103.

[2]Sanderson RJ,Ironside JAD.Squamous cell carcinoma of the head and neck[J].B MJ,2002,325:822.

[3]Hutchens TW,Yip TT.New desorption strategies for the mass spectrometric analysis of macromolecules[J].Rapid Commun Mass Spectrom,1993,7:576.

[4]Adam BL,Qu Y,Davis JW,et al.Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men[J].Cancer Res,2002,62:3609.

[5]Petricoin EF,Ardekani AM,Hitt BA,et al.Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer[J].Lancet,2002,359:572.

[6]Azad NS,Rasool N,Annunziata CM,et al.Proteomicsin clinical trials and practice:present uses and future promise[J].Mol Cell Proteomics,2006,5:1819.

[7]Wadsworth JT,Somers KD,Cazares LH,et al.Serum protein profiles to identify head and neck cancer[J].Clin Cancer Res,2004,10:1625.

[8]肖雪媛,赵小冬,刘剑凯,等.利用蛋白质组学方法筛选及确定喉癌诊断的标志分子[J].中国科学C辑生命科学,2004,34:49.

[9]张秀强,陈 瑛,王巾帼,等.表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱血清蛋白指纹图谱在喉癌诊断中的应用[J].临床耳鼻咽喉科杂志,2006,20:842.

Analysis of serum protein spectra in patients with laryngeal carcinoma by SELDI-TOF-MS

WANGXiu-li,GAO Chun-fang,ZHAOGuang,et al.(Institute of Anal-colorectal surgery,150th Central Hospital of PLA,Luoyang471031,China)

ObjectiveTo explore the distinct expression of serum protein biomarkers of laryngeal carcinoma and create a decision classification tree model for diagnosing laryngeal carcinoma.MethodsSerum samples from 57 laryngeal carcinoma patients and 64 health people were collected and their serum protein fingerprinting were read by surface enhanced laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry(SELDI-TOF-MS).The Biomarker Wizard and Biomarker Patter software were used to screen and analyze the distinct proteins between the two groups.The best classification tree model was created for diagnosing laryngeal carcinoma.Then the model was blindly validated using another group of serum samples(15 from laryngeal carcinoma and 20 from healthy).ResultsTwenty-four distinct proteins of statistical significance were found between the sera from patients of laryngeal carcinoma pre-operation and healthy people(P＜0.05).The best decision classification tree model was successfully established,which included 4 kinds of proteinswith the mass-to-charge ratio 4206,6623,8 928 and 9 424Da.The accuracy of diagnosis was 95.0%(115/121),the sensitivity and specificity were 94.7%(54/57)and 95.3%(61/64),respectively.Blind test generated a sensitivity of 86.7%(13/15)and a specificity of 85.0%(17/20).Furthermore,the eight proteins over-expressed in serum from pre-operationwere obviously downregulated after operation.ConclusionThe diagnostic modelof serum fingerprinting is useful and offers a new approachfor early diagnosing laryngeal carcinoma and screening prognostic biomarkers.

laryngeal carcinoma;SELDI-TOF-MS;biological markers;mass-to-charge ratio(M/Z)

R739.65

A

1007-4287(2010)09-1437-04

book=1440,ebook=509

2009-11-20)