急性肝坏死动物模型肠道SIgA的变化

刘冬妍，丁鹏，刘沛

（中国医科大学1.附属盛京医院实验研究中心，沈阳 110004；2.附属第一医院感染科，沈阳 110001）

肝坏死是一类肝细胞广泛坏死的晚期病症，患者可出现消化道出血、内毒素血症、自发性腹膜炎、肝性脑病、中毒性鼓肠、甚至败血症等。肠黏膜免疫系统在机体担任第一线的局部防御任务，黏膜免疫是抑制免疫不是激活免疫［1］，黏膜免疫系统由许多机制抵抗各种损伤以保护宿主，如分泌性免疫球蛋白（secretory IgA，SIgA）、肠上皮淋巴细胞。肠黏膜SIgA是肠道第一线的免疫防御，对黏膜固有的和入侵的病原体具有保护作用，尤其对肠道菌群中的G-杆菌具有特殊的亲和力［2］，阻止其与肠上皮细胞的吸附，避免细菌穿透肠上皮发生易位，是阻止细菌易位的重要环节。因而在探讨急性肝坏死并发自发性腹膜炎发生机制时，研究肠道SIgA变化至关重要。本研究检测急性肝坏死动物模型血清、粪便内SIgA，并检测肠壁内IgA的蛋白定位，以了解急性肝坏死肠道免疫防御功能的改变。

1 材料与方法

1.1 动物分组及动物模型建立

由中国医科大学动物中心提供雄性Balb/C小鼠250只，6～8周龄，体质量18～22 g，随机分为4组。1组：生理盐水对照组，50只；2组：LPS（E.coliO127：B8） 组，50 只；3 组：D-氨基半乳糖组（GalN组），50只；4组：肝坏死组（LPS+GalN 组），100只。各组分 5 个时间点（2，6，9，12，24 h），每个时间点取10 只小鼠。GalN 800 mg/kg，LPS 10 μg/kg，均为腹腔注射，生理盐水为相同体积的腹腔注射，在不同时间点处死小鼠取肝肠组织。

1.2 标本的处理

（1）摘眼球取血，待充分凝固后，3 000 r/min离心取上清，-30℃冰冻保存待用；（2）取干便称重，按1/10加入pH7.4的PBS，漩涡振荡器充分震荡后以10 000 r/min低温离心机离心，取上清-30℃冰冻保存待用。

1.3 ELISA方法检测血清、粪便IgA

用抗小鼠IgA抗体（Sigma公司）包被96孔聚苯乙烯反应板4℃过夜。10%小牛血清封闭，依次加入标本、生物素标记的抗小鼠IgA抗体（Sigma公司）、卵白素耦联的辣根过氧化物酶（Sigma公司）和底物，用硫酸终止反应，以包被液做空白对照，封闭液做阴性对照，450 nm波长检测吸光度值（A值）［3］。

1.4 放射免疫方法检测粪便SIgA

从冰箱中取出粪便上清液和血清平衡到室温，设立非特异标准管、零标准管、6个标准管、T管。T管仅加I125-SIgA，非特异标准管加I125-SIgA和非特异结合试剂，零标准管加I125-SIgA和SIgA抗体，6个标准管加I125-SIgA、SIgA抗体和不同浓度的标准品，样品管依次加入100 μl标本、I125-SIgA和SIgA抗体，充分混匀，37℃温育1.5 h，加入第二抗体和PEG，充分混匀，37℃孵育0.5 h，3 500 r/min离心15 min，弃上清，沉淀和T管在γ闪烁技术仪上计数60 s，计数非特异结合率。

1.5 肠上皮IgA免疫组化染色

颈椎脱臼处死小鼠，取肠组织，迅速放入福尔马林中，石蜡包埋后切成6 μm厚切片，常规二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，然后依次加入H2O2、兔血清、1∶800稀释的抗SC抗体（美国ICN公司）、生物素标记的IgG抗体、酶标记的卵白素、DAB显色。用图像分析软件分析SC染色的平均OD值。

1.6 统计学处理

采用SPSS 10.0软件进行t检验，数据以±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组动物死亡情况

第4组小鼠注射以后，出现懒动，摄水、觅食减少，皮毛松散，甚至抽搐，于注射后6 h开始死亡，9 h达高峰，死亡率达56%。

2.2 动物模型肠、肝组织形态学检查

2.2.1 肝组织：HE染色光镜下由LPS/GalN引起的急性肝坏死随时间逐渐加重，2 h肝脏有少量点状坏死，6 h肝脏出现多处点状坏死，9 h、12 h可见成片的出血性坏死，残存的肝细胞肿胀，坏死区可见大量炎细胞。24 h有多处点状坏死，肝细胞肿胀，多处出血，灶状坏死处有淋巴细胞浸润（图1）。

2.2.2 肠组织：HE染色光镜下见对照组肠绒毛完整，无上皮脱落及碎屑形成，坏死组部分绒毛不整，细胞水肿及炎细胞浸润（图2）。

2.3 粪便SIgA的变化

LPS引起的肝坏死小鼠便SIgA含量升高与对照组相比均有统计学差异（P<0.01），在9 h达到高峰，注射LPS、GalN亦引起便SIgA含量升高（图3）。

2.4 粪便、血液IgA的变化

注射LPS+GalN 6 h便、血清IgA开始升高，维持到24h，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。见图4。

2.5 肠上皮IgA变化

IgA染色可见正常肠组织肠上皮细胞质、细胞膜和固有层活化淋巴细胞呈棕黄色强阳性；急性肝坏死肠组织肠上皮细胞质阳性明显减弱（图5），IgA的光密度变化如图6。

3 讨论

肠道在严重疾病伴发的多器官功能衰竭中起主要作用［4］，在此过程中肠道黏膜SIgA是一个重要参与因素，它能阻止细菌［5］、病毒［6～8］和其他毒性分子粘附在黏膜表面。

我们应用LPS和GalN联合注射建立急性肝坏死动物模型，GalN是一种氨基糖，在肝内通过半乳糖途径代谢，消耗半乳糖代谢途径的中间产物尿苷二磷酸，进而抑制尿嘧啶核苷的代谢，通过抑制肝细胞RNA和浆膜蛋白的合成造成肝细胞破坏［9］。GalN可使动物对LPS的敏感性呈万倍的增加，而肝坏死引起的内毒素血症进一步加重GalN的肝毒性［10］。对实验小鼠肝脏进行形态学检查发现，由LPS和GalN引起的急性肝坏死随时间逐渐加重，在9 h最重，可见肝脏体积明显变大，颜色呈酱紫色，HE染色可见成片的出血性坏死，残存的肝细胞肿胀，坏死区可见大量炎细胞。国外有报道严重酒精性肝病时血清SIgA显著增高，肠道SIgA显著下降［11］，但也有报道在酒精性肝病时肠道IgA明显升高［12］。慢性病毒性肝炎和肝硬化患儿唾液和粪便滤过液SIgA升高，呈现高球蛋白血症症状，局部免疫功能增强［13］。用螺旋菌诱导的慢性活动性肝炎小鼠粪便和胆汁内IgA均显著高于正常对照组［14］。我们结果显示，注射后坏死组粪便IgA和SIgA、血液IgA均显著高于对照组、LPS组、GalN 组（P<0.01），在 9 h达最高，即肝坏死越重，血清IgA和便中IgA、SIgA越高。小鼠SC介导IgA运输不仅在肠道而且可以在肝脏，由于肝细胞IgA泵的缺失导致血清IgA升高，大量IgA堆积肝脏，同时由于IgA的肠肝循环［15］，肝脏内的IgA通过肠肝循环进入肠道引起粪便中IgA增加，因此小鼠粪便IgA不能反映肠道真实IgA的分泌情况［16］。我们对肠组织进行免疫组化染色，发现由LPS+GalN引起的IgA免疫组化光密度明显低于对照组、LPS组。因此我们推测即使便中SIgA、IgA升高，但在急性肝坏死时由于肠黏膜上皮细胞表面IgA（SIgA）减少，导致肠道免疫功能下降。同时急性肝坏死时肠道营养不良可能也是引起肠黏膜上皮细胞表面IgA减少的原因。由于IgA是SIgA的重要组成成分，SIgA又是肠道第一线免疫防御，因此IgA减少可能是急性肝坏死并发腹膜炎的一个原因。

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